本文選題：手足口病 + 基因工程疫苗��； 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一種全球性的傳染性疾病,主要發(fā)生在以亞太地區(qū)為主的發(fā)展中國家。中國自1981年在上海第一次發(fā)現(xiàn)手足口病案例后,全國范圍內(nèi)多次爆發(fā)手足口病疫情,鑒于其發(fā)病數(shù)為丙類傳染病之首,被喻為21世紀的“脊髓灰質(zhì)炎”。引起手足口病的病原體為小RNA病毒科(Picornaviradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員。依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),其中最為常見的病原體為腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯薩奇A16型(Coxsackie A16,CVA16),約占總發(fā)病人數(shù)80%以上,感染對象主要為5歲以下的兒童,約占總發(fā)病人數(shù)的90%。臨床研究發(fā)現(xiàn),感染EV71后有時會誘導(dǎo)發(fā)生一系列嚴重的神經(jīng)性疾病,甚至?xí)䦟?dǎo)致兒童死亡,而CVA16型感染導(dǎo)致的臨床癥狀較溫和。目前臨床上尚未有針對嚴重手足口病發(fā)生的有效治療性藥物,因此預(yù)防性疫苗的研制與接種作為控制手足口病發(fā)生的重要手段顯得至關(guān)重要。鑒于手足口病已經(jīng)成為公眾健康的重要隱患問題,而病原體EV71具有大規(guī)模爆發(fā)性和嚴重的嗜神經(jīng)性,目前EV71已成為當前手足口病研究領(lǐng)域的重點研究對象。本文將以EV71病原體作為手足口病基因工程疫苗的主要研究對象。目前,HFMD疫苗以滅活疫苗和病毒樣顆粒(VLPs)疫苗為主要研究形式。然而隨著基因工程技術(shù)研究的不斷發(fā)展,VLPs疫苗以其獨有的天然優(yōu)勢已被廣泛應(yīng)用。其中乙肝病毒(HBV)VLPs疫苗和人乳頭瘤病毒(HPV)VLPs疫苗的成功上市也為EV71 VLPs疫苗的研制提供了理論依據(jù)。盡管已有利用酵母系統(tǒng)(畢赤酵母、釀酒酵母系統(tǒng)),昆蟲細胞(Sf9 cells)桿狀病毒表達系統(tǒng)表達制備EV71 VLPs疫苗的研究報道,但均是以實驗室方法(蔗糖密度梯度和Cs Cl密度梯度超速離心)純化獲得。而這種實驗室純化方法具有自身的局限性,因其生產(chǎn)工藝費時費力,成本昂貴,不利于疫苗的規(guī)模化研制及臨床研究。為此,色譜層析純化方法成為EV71 VLPs疫苗研制勢在必行的關(guān)鍵因素。本論文針對以上的問題進行全面、具體、深入的研究。首先對EV71 VLPs疫苗表達條件進行優(yōu)化,其次建立一種新型的多步色譜層析方法,最后對該方法制備的EV71 VLPs疫苗進行表征和有效性評價。以期獲得符合藥典相關(guān)要求的II EV71 VLPs基因工程疫苗,解決目前EV71 VLPs疫苗實驗室方法研制純化中存在的問題。本研究主要分為以下兩個部分:第一部分:EV71 VLPs疫苗上游表達條件的優(yōu)化和下游純化方法的建立一、根據(jù)中國大陸手足口病流行性病學(xué)調(diào)查研究,我們選取EV71 C4流行株(EU703814.1),利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)制備EV71 VLPs,并對其進行細胞培養(yǎng)和重組病毒表達條件的優(yōu)化,最終篩選出EV71 VLPs疫苗的最適表達條件。二、色譜層析純化是制備高質(zhì)量EV71 VLPs疫苗的重要手段。本研究通過新型流穿式的色譜層析柱(Capto TM Core700)、復(fù)合式強陰離子交換層析柱(Capto TM adhere)和弱疏水性層析柱(Capto TM butyl)的聯(lián)合使用,建立一種新型的多步色譜層析方法,成功純化了EV71 VLPs并進行檢定,制備出針對手足口病的高純度EV71 VLPs疫苗。第二部分:EV71 VLPs疫苗的表征和有效性的初步評價一、通過免疫熒光及原位免疫膠體金染色技術(shù)對EV71 VLPs進行細胞定位,結(jié)果顯示本實驗表達的EV71 VLPs主要存在于細胞質(zhì)中。并對純化終產(chǎn)物的純度、宿主細胞雜質(zhì)、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、直徑、氨基酸序列、分子量、等電點、糖位點修飾等進行檢測,結(jié)果表明本實驗制備的疫苗符合藥典的相關(guān)規(guī)定。二、利用Octet Red96 system(Forte Bio)蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng),對抗體與抗原的親和性進行檢測,發(fā)現(xiàn)其與22A12 m Ab有較高的親和力,驗證了EV71 VLPs疫苗具有良好的抗原性;通過動物免疫,利用本實驗室建立的假病毒檢測平臺評價疫苗的中和抗體效價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與EV71滅活疫苗相比,EV71 VLPs疫苗具有較高的中和抗體滴度,證明了EV71 VLPs具有良好的免疫原性。三、體內(nèi)保護力檢測實驗是評價該實驗方法制備EV71 VLPs疫苗有效性的重要指標之一。我們通過TEM、HPLC、動物免疫、乳鼠體內(nèi)免疫攻毒實驗,驗證了EV71 VLPs不僅具有良好的穩(wěn)定性,同時還具有100%的體內(nèi)免疫保護效果,可預(yù)防同源病毒的攻擊。綜上所述,通過搖瓶培養(yǎng)和WAVE生物反應(yīng)器,我們優(yōu)化了Sf9細胞的培養(yǎng)條件及EV71 VLPs疫苗的表達條件,為疫苗的下游純化研究提供了強有力的依據(jù)。本研究成功的培養(yǎng)、純化、表征手足口病基因工程疫苗,即昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)和多步色譜層析純化方法制備的EV71 VLPs疫苗。該疫苗純度可達95%以上,回收率為31.52%,具有良好的表征特性和穩(wěn)定性,免疫后可產(chǎn)生約為215的中和抗體滴度,對同一亞型EV71致死劑量攻毒的乳鼠具有100%的體內(nèi)保護率。因此,本實驗建立的多步色譜層析方法是很有希望能夠成為EV71VLPs疫苗規(guī)�；a(chǎn)的理論依據(jù),且該實驗方法制備的EV71 VLPs疫苗也有希望成為一種有效的手足口病基因工程疫苗。本論文的創(chuàng)新點:在本研究中,我們首次建立了一種新型多步色譜純化工藝,成功制備了純度大于95%的EV71 VLPs疫苗。首次驗證Sf9細胞對EV71 VLPs的翻譯后修飾并確定了其具體的N-糖基化修飾位點,首次對多亞基EV71 VLPs疫苗進行一級結(jié)構(gòu)分析。在細胞水平上對該疫苗的表達進行定位,對該疫苗的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和抗原性等特征進行全面表征,在動物水平上評價了該疫苗的免疫原性,并利用已有的動物模型評價了該疫苗的免疫保護性。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Kaw Bing Chua;Abdul Rasid Kasri;;Hand Foot and Mouth Disease Due to Enterovirus 71 in Malaysia[J];Virologica Sinica;2011年04期

2 ;Expression,purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles[J];World Journal of Gastroenterology;2006年06期

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本文編號：1758071