本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點：Rv2657c蛋白　出處：《河北北方學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的傳染病,主要通過呼吸道傳播。據(jù)報道2015年結(jié)核病患者已超過1000萬,嚴(yán)重威脅著人類的健康。MTB感染人體后可出現(xiàn)三種不同的結(jié)果,一是機體免疫力較好,MTB直接被清除;二是MTB被機體免疫抑制,但也不能完全清除,發(fā)展為結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI);三是MTB在機體內(nèi)迅速增殖,發(fā)展成活動性結(jié)核病。世界衛(wèi)生組織估計全球1/3的人口是MTB的潛伏感染人群,而新發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)核患者有85%-90%是由潛伏感染人群發(fā)展而來,故若能早期診斷LTBI者,并盡早對其進(jìn)行預(yù)防治療可大大降低結(jié)核病的發(fā)病率。但是目前缺乏監(jiān)測、診斷LTBI的有效而可靠的標(biāo)志物。LTBI的篩查對于結(jié)核病的防控具有重要的意義和價值。本研究的目的是試圖發(fā)現(xiàn)LTBI的診斷標(biāo)記物。在機體處于LTBI階段時,潛伏感染相關(guān)蛋白會上調(diào)表達(dá),有可能成為潛伏感染的診斷標(biāo)志物。Rv2657c是MTB處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)時上調(diào)表達(dá)的蛋白,其編碼基因位于MTB與卡介菌(M.bovis Bacille Calmette-Guerin,BCG)基因組的差異區(qū)(region of difference,RD)。Rv2657c蛋白由86個氨基酸組成,基因長度為261bp,相對分子質(zhì)量為9506.8Da,等電點為9.2211,分泌可能的phirv2噬菌體蛋白,功能未知。本研究應(yīng)用DNAStar軟件預(yù)測Rv2657c蛋白的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位;應(yīng)用Blast方法分析該蛋白氨基酸序列與人類蛋白序列的相似性;分別用BIMAS量化基序法、NetCTL法和SYFPEITHI超基序法預(yù)測蛋白的CTL表位;分別用SYFPEITHI超基序法和RANKPEP法遠(yuǎn)程預(yù)測Th細(xì)胞表位,從中篩選表位較集中、得分較高者作為候選多肽片段。應(yīng)用TMHMM軟件對蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測,使用PSORT version軟件進(jìn)行蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位,應(yīng)用SignalP軟件2.0和SignalP 4.0 Server進(jìn)行信號肽分析。構(gòu)建表達(dá)Rv2657c重組蛋白(r Rv2657c)的大腸桿菌(E.coli)工程菌,然后誘導(dǎo)rRv2657c蛋白表達(dá),繼而純化rRv2657c蛋白。通過蛋白免疫印記法(Western blot)及酶聯(lián)免疫斑點(Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)方法初步研究其免疫學(xué)特性,其中ELISPOT檢測,以早期增殖期蛋白---培養(yǎng)濾過蛋白10和早期分泌抗原靶6重組融合蛋白(CFP10-ESAT6,CE)為對照,以rRv2657c刺激健康防癆工作人群和活動性結(jié)核病人群的外周血單個核細(xì)胞,檢測分泌γ干擾素的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞斑點數(shù)(SFCs),比較其在不同人群里的差別。Protean軟件預(yù)測結(jié)果表明Rv2657c蛋白親水性、柔韌性及抗原性較好,表面可及性較弱,α螺旋和β折疊數(shù)量較多且分布范圍廣泛,卷曲、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)少,有5個B細(xì)胞表位,表位總長度占蛋白氨基酸全長的50%,主要集中在第14位氨基酸之后;預(yù)測該蛋白有6個T細(xì)胞表位,表位總長度占蛋白氨基酸全長的38.4%,主要集中在第10位氨基酸之后。BIMAS量化基序法、NetCTL法、和SYFPEITHI超基序法預(yù)測該蛋白有6個CTL表位,其中以HLA-A2限制性表位數(shù)目較多,得分較高;SYFPEITHI超基序法和RANKPEP法預(yù)測該蛋白有38個Th表位,其中以HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701表型表位數(shù)目較多。TMHMM軟件、PSORT version軟件、SignalP軟件2.0和SignalP 4.0 Server預(yù)測Rv2657c蛋白是一個無信號肽,不分泌的胞漿蛋白。我們成功構(gòu)建了表達(dá)rRv2657c蛋白的E.coli工程菌,并獲得了純化的蛋白。Western Blot實驗結(jié)果顯示rRv2657c蛋白與結(jié)核潛伏感染豚鼠血清反應(yīng)結(jié)果為陽性,健康對照組反應(yīng)結(jié)果為陰性。ELISPOT實驗結(jié)果顯示rRv2657c蛋白在健康防癆工作人員組的SFCs值(11)明顯高于活動性結(jié)核病組(1.5)(p0.05)。綜上所述,Rv2657c蛋白是一個既有B細(xì)胞表位也有T細(xì)胞表位的抗原,以B細(xì)胞表位占優(yōu)勢。重組Rv2657c蛋白分子量為12.8kDa,以可溶性及包涵體兩種形式表達(dá),但以可溶性表達(dá)為主,采用金屬離子親和層析方法純化,通過超濾法濃縮蛋白。純化獲得的rRv2657c蛋白在Western Blot試驗中證明其有較好的抗原性;在Elispot試驗中證明其有較好的免疫原性,有可能成為潛伏感染診斷的標(biāo)志物。
[Abstract]:緇撴牳鐥呮槸緇撴牳鍒嗘灊鏉嗚弻(Mycobacterium tuberculosis,MTB)寮曡搗鐨勪紶鏌撶梾,涓昏閫氳繃鍛煎惛閬撲紶鎾，

本文編號：1698776