本文選題：中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)染　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2013年11期

【摘要】：目的構(gòu)建中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(MANF)基因真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系(N2A),建立穩(wěn)定表達(dá)MANF的細(xì)胞系,并觀察MANF對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。方法將MANF基因克隆至pEGFP-C2載體中,經(jīng)酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、測(cè)序檢測(cè)其構(gòu)建的正確性,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入N2A細(xì)胞,經(jīng)G418(500μg/ml)連續(xù)篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)MANF的神經(jīng)細(xì)胞系。細(xì)胞免疫熒光法觀察MANF的定位,蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和反轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中MANF的蛋白和基因表達(dá)水平。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中,分別用4μg/ml衣霉素(TM)處理16 h和10μmol/Lβ淀粉樣蛋白(Aβ)處理24 h誘導(dǎo)ER應(yīng)激,Western blot法檢測(cè)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)的表達(dá)和Caspase-3的激活情況。結(jié)果構(gòu)建的pEGFP-C2-MANF質(zhì)粒經(jīng)酶切測(cè)序等鑒定確定構(gòu)建成功,經(jīng)G418抗性篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MANF的N2A細(xì)胞系,RT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光法證明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中MANF的基因和蛋白水平均高表達(dá),并且MANF的細(xì)胞定位準(zhǔn)確。誘導(dǎo)ER應(yīng)激后,MANF能顯著抑制CHOP的表達(dá)和Caspase-3的激活。結(jié)論成功建立穩(wěn)定表達(dá)MANF的神經(jīng)細(xì)胞系,并且發(fā)現(xiàn)MANF可以抑制ER應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Objective to construct the eukaryotic expression plasmid of mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF-) gene and transfect it into mouse neuroma cell line (N2AN), and to establish a cell line stably expressing MANF. To observe the effect of MANF on the apoptosis induced by endoplasmic reticulum (ER) stress. Methods the MANF gene was cloned into pEGFP-C2 vector, then digested by enzyme, polymerase chain reaction (PCR) and sequenced. The recombinant plasmid was transfected into N2A cells by liposome transfection. After continuous screening by G418G / ml, the stable expression of MANF in neural cell lines was obtained. The localization of MANF was observed by immunofluorescence assay. Western blotting and reverse transcription PCR assay were used to identify the protein and gene expression of MANF in stable transfected cell lines. The expression of CCAAT enhancer binding protein homologous protein (Caspase-3) and the activation of Caspase-3 were detected by ER stress Western blot method after treatment with 4 渭 g/ml and 10 渭 mol/L 尾 amyloid A 尾 for 16 h and 10 渭 mol/L 尾 -amyloid A 尾 for 24 h, respectively. Results the constructed pEGFP-C2-MANF plasmid was digested by enzyme. Sequence and other appraisals determined that the construction was successful, The stable MANF transfected N2A cell line was screened by G418 resistance. The expression of MANF gene and protein in the transfected N2A cell line was confirmed by Western blot and immunofluorescence assay. After inducing ER stress, the expression of CHOP and the activation of Caspase-3 were significantly inhibited by MANF. Conclusion the stable expression of MANF was successfully established and the apoptosis of neurons induced by ER stress was inhibited by MANF.
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;安徽醫(yī)科大學(xué)生物藥物研究所;安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):91129729、81173074) 教育部博士點(diǎn)基金(博導(dǎo)類)(編號(hào):20113420110004)
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1679767