本文選題：寒凝血瘀證　切入點(diǎn)：子宮內(nèi)膜異位癥　出處：《黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：1利用SD大鼠建立中醫(yī)病癥結(jié)合的寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型,通過(guò)該模型觀察不同時(shí)期所建立的移植內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化及鏡下病理學(xué)改變,確定寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型的治療性給藥時(shí)間點(diǎn)及預(yù)防性給藥時(shí)間點(diǎn)。2觀察痛愈舒顆粒不同治療劑量對(duì)寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型的影響,通過(guò)比較移植內(nèi)膜體積變化,檢測(cè)正常和異位內(nèi)膜ANXA2、RAC1、LIMK1的表達(dá)差異,提出“伏寒傷腎,致瘀損絡(luò)”為寒凝血瘀型內(nèi)異癥的中醫(yī)病機(jī),探討痛愈舒顆粒治療寒凝血瘀型內(nèi)異癥的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)作用機(jī)制,通過(guò)中西醫(yī)結(jié)合為臨床試驗(yàn)提供依據(jù)。3分別觀察痛愈舒顆粒的預(yù)防性劑量以及治療性劑量對(duì)寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型的影響,通過(guò)對(duì)比用藥后移植內(nèi)膜體積的變化,并檢測(cè)異位內(nèi)膜ANXA2、RAC1、 LIMK1的表達(dá)差異,探討痛愈舒顆粒預(yù)防性用藥的可行性及相應(yīng)的作用機(jī)制。方法：1實(shí)驗(yàn)一：選取30只雌性未交配SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組5只、模型組25只。采用將自體子宮內(nèi)膜移植法和冰水浸泡法相結(jié)合的方式建立寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型。模型組隨機(jī)分為5組,分別在造模后第3天、第5天、第4周、第6周及第8周觀察造模大鼠的中醫(yī)表征,測(cè)量移植內(nèi)膜體積,獲取組織內(nèi)膜通過(guò)HE染色進(jìn)行病理學(xué)觀察,組間進(jìn)行對(duì)比。2實(shí)驗(yàn)二：選取112只雌性未交配SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組12只、模型組100只。模型組按實(shí)驗(yàn)一方法建立寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型。術(shù)后4周進(jìn)行開(kāi)腹探查,選取72只成功建模的SD大鼠隨機(jī)分為模型4周組、模型8周組、中低組(經(jīng)痛愈舒中藥低劑量組)、中中組(經(jīng)痛愈舒中藥中劑量組)、中高組(經(jīng)痛愈舒中藥高劑量組)和西藥組各12只。模型4周組直接處死進(jìn)行病理學(xué)檢查,用藥組每日同一時(shí)間按相應(yīng)藥物及劑量進(jìn)行灌胃。模型8周組與對(duì)照組行生理鹽水每日灌胃。灌胃4周后全體處死。所有造模大鼠測(cè)量異位內(nèi)膜體積變化：病灶取材進(jìn)行HE染色及病理學(xué)觀察；通過(guò)RT-PCR和Westernblot檢測(cè)組織中ANXA2mRNA和ANXA2蛋白的表達(dá)情況；通過(guò)免疫組化檢測(cè)組織中ANXA2、RAC1和LIMK1的表達(dá)。確定經(jīng)痛愈舒的最佳用藥劑量。3實(shí)驗(yàn)三：選取60只雌性未交配SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組12只、模型組48只。模型組按實(shí)驗(yàn)一方法建立寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型。術(shù)后5天開(kāi)腹探查,選取36只成功建模的大鼠隨機(jī)分為預(yù)防組、模型4周組、中高組。預(yù)防組術(shù)后5天開(kāi)始每日冰水浸浴,持續(xù)2周,同時(shí)開(kāi)始予以高劑量經(jīng)痛愈舒灌胃,用藥4周后處死。模型4周組術(shù)后1周開(kāi)始冰水浴,持續(xù)2周,術(shù)后4周處死。中高組術(shù)后1周開(kāi)始冰水浴,持續(xù)2周,術(shù)后4周開(kāi)始高劑量經(jīng)痛愈舒灌胃,持續(xù)4周,術(shù)后8周處死。所有大鼠標(biāo)本觀察項(xiàng)目同實(shí)驗(yàn)二。結(jié)果：1實(shí)驗(yàn)一結(jié)果：通過(guò)改良的自體移植法和冰水浸泡法相結(jié)合建立寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型,造模成功率為76%。所建模型大鼠寒邪表征穩(wěn)定,停止冰水浴后寒凝血瘀征象持續(xù)存在。通過(guò)所建模型觀察移植內(nèi)膜變化,造模3天,移植物形狀無(wú)明顯改變；造模后5天病灶表面可見(jiàn)新生血管出現(xiàn),周?chē)梢?jiàn)炎性反應(yīng)；造模4周移植物體積較前明顯增大,可見(jiàn)典型的內(nèi)異癥表現(xiàn)；造模6周的移植物與4周時(shí)進(jìn)行比較,其外觀無(wú)明顯變化或體積略有增大；造模8周時(shí)部分移植物出現(xiàn)體積縮小。通過(guò)比較不通時(shí)期異位內(nèi)膜病灶體積變化,我們觀察到：腹壁病灶在造模后4周,平均體積達(dá)到高峰,持續(xù)到造模8周左右,造模第8周以后,部分病灶體積開(kāi)始縮小。確定造模4周為治療性用藥的干預(yù)時(shí)間點(diǎn),造模5天為預(yù)防性用藥的干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。2實(shí)驗(yàn)二結(jié)果：本組寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠成模率80%。通過(guò)用藥治療,中藥組模型大鼠的寒凝血瘀外觀明顯改善,西藥組無(wú)明顯變化。各治療組移植的異位病灶體積明顯縮小,以中高組和西藥組的變化最為明顯。通過(guò)對(duì)異位組織標(biāo)本的病理學(xué)觀察,各治療組異位內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)出現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)受限,以中高組和西藥組的變化最為明顯。3 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較,各模型組和治療組ANXA2 mRNA和蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的增高；與模型4周組進(jìn)行比較,ANXA2在模型8周組的表達(dá)有所升高,各治療組ANXA2的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的降低,中高組與西藥組的表達(dá)無(wú)顯著性差異。ANXA2 mRNA與ANXA2蛋白的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性。4免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,ANXA2、RAC1和LIMK1在各模型組和治療組的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的升高；與模型4周組比較,三項(xiàng)指標(biāo)在模型8周組的表達(dá)均有不同程度的表達(dá)升高,而在各治療組的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的降低,中高組與西藥組的表達(dá)無(wú)明顯差異。Pearson相關(guān)分析顯示,三者的表達(dá)趨勢(shì)存在正相關(guān)。5實(shí)驗(yàn)三結(jié)果：本組寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠成模率75%。。預(yù)防組大鼠未出現(xiàn)明顯寒凝血瘀的表現(xiàn)。預(yù)防組經(jīng)過(guò)用藥移植內(nèi)膜體積明顯縮小,同時(shí)預(yù)防組移植內(nèi)膜體積明顯小于中高組的內(nèi)膜體積。6 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較,各模型組ANXA2mRNA和蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的增高；與模型4周組進(jìn)行比較,ANXA2在預(yù)防組和中高組的表達(dá)均出現(xiàn)明顯降低,；預(yù)防組的表達(dá)低于中高組的表達(dá)。ANXA2 mRNA與ANXA2蛋白的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性。7免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組進(jìn)行比較,ANXA2、RAC1和LIMK1在各模型組中的表達(dá)出現(xiàn)不同程度升高；與模型4周組進(jìn)行比較,3項(xiàng)指標(biāo)在預(yù)防組和中高組的蛋白表達(dá)量均明顯降低；預(yù)防組的蛋白表達(dá)量低于中高組。Pearson相關(guān)分析顯示,三者的表達(dá)趨勢(shì)存在正相關(guān)。結(jié)論：1.結(jié)合自體移植法和冰水浸浴法,選取SD大鼠,建立寒凝血瘀型內(nèi)異癥大鼠模型,獲取的移植內(nèi)膜具備病理學(xué)檢測(cè)的成模標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)該造模方法可獲得穩(wěn)定的,可重復(fù)的研究模型。2.提出了“伏寒傷腎,致瘀損絡(luò)”的中醫(yī)學(xué)關(guān)于內(nèi)異癥的理論,從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究關(guān)于“內(nèi)異癥3A理論”中的粘附角度進(jìn)行探索,通過(guò)中西醫(yī)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)手段探討內(nèi)異癥的病機(jī)、尋找治療內(nèi)異癥的靶點(diǎn)并指導(dǎo)臨床用藥。3.ANXA2mRNA和ANXA2蛋白在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)明顯升高,并隨病情的進(jìn)展與緩解出現(xiàn)表達(dá)量的相應(yīng)變化,推測(cè)ANXA2在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有一定的作用。異位內(nèi)膜組織中的ANXA2、RAC1和LIMK1存在一致的表達(dá)趨勢(shì),推測(cè)ANXA2可能通過(guò)ANXA2-RAC1-LIMK1這一信號(hào)通路促進(jìn)病變發(fā)展,其通路上的分子標(biāo)志物可作為疾病發(fā)展預(yù)測(cè)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。4.痛愈舒顆�？捎行б种坪鲂蛢�(nèi)異癥的病情進(jìn)展,促進(jìn)異位內(nèi)膜的萎縮,降低組織中ANXA2、RAC1和LIMK1的表達(dá),具有與西藥相同的治療效果,在改善寒凝表征方面比西藥更具優(yōu)勢(shì)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)最終確定高劑量的痛愈舒顆粒是臨床治療寒凝血瘀型內(nèi)異癥的最佳劑量。5.預(yù)防性的應(yīng)用痛愈舒顆粒具有對(duì)異位內(nèi)膜更好的抑制作用,相較于針對(duì)成熟異位內(nèi)膜的用藥,預(yù)防性用藥具有更好的治療效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5;R-332

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