本文選題：NDRG2　切入點(diǎn)：谷氨酸　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及維持突觸可塑性等方面發(fā)揮重要作用。在生理狀態(tài)下,谷氨酸起信號傳導(dǎo)作用。在病理狀態(tài)下,谷氨酸濃度在細(xì)胞外液迅速升高[1]。高濃度的谷氨酸引起神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)超載,最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[1],即谷氨酸的興奮毒性[2]。因此,迅速有效地將突觸間隙的谷氨酸移除有利于維持正常的突觸傳遞功能。突觸間隙不存在使谷氨酸滅活的酶,從突觸間隙攝取谷氨酸是終止谷氨酸作用的最主要途徑。谷氨酸的移除主要依賴興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAATs,EAATs能逆濃度梯度將谷氨酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),負(fù)責(zé)谷氨酸攝取的主要細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞[3,4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞Na~+依賴性的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體是EAAT1和EAAT2。EAATs每轉(zhuǎn)運(yùn)1個谷氨酸分子,伴有3個Na~+和1個H~+同向轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),1個K~+轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外[5]。這種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能量來源是Na~+-K~+-ATP酶形成的Na~+、K~+電化學(xué)濃度梯度。但是,星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)谷氨酸攝取的關(guān)鍵分子和機(jī)制尚未明了。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),NDRG2特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞[6,7]。在腦內(nèi)興奮性毒性狀態(tài)下,如缺血[8]、創(chuàng)傷[9]和AD[10]時(shí)表達(dá)上調(diào)。既往研究證實(shí):Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基能與NDRG2相互作用,NDRG2通過抑制Na~+/K~+-ATPaseβ1蛋白泛素化起到穩(wěn)定后者的作用[11]。為了研究在生理及病理狀態(tài)下NDRG2的功能,我們構(gòu)建了NDRG2敲除(Ndrg2-/-)小鼠。這些小鼠表現(xiàn)為運(yùn)動亢進(jìn)和腦細(xì)胞外液谷氨酸增多,推測該基因可能是調(diào)節(jié)谷氨酸攝取的關(guān)鍵分子。本研究旨在探討表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的NDRG2是否通過影響細(xì)胞Na~+/K~+-ATPase活性進(jìn)而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT1、EAAT2對谷氨酸的攝取從而發(fā)揮保護(hù)作用?第一部分NDRG2調(diào)節(jié)腦組織細(xì)胞外液谷氨酸濃度,保持谷氨酸濃度的動態(tài)平衡目的:探討NDRG2對小鼠運(yùn)動距離、運(yùn)動速度及腦組織細(xì)胞外液谷氨酸濃度的影響。方法:選取6~8周齡雄性C57BL/6J、Ndrg2-/-小鼠,Ndrg2-/-小鼠用LV-NDRG2或LV-Ctrl進(jìn)行側(cè)腦室注射,五天后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn),觀察小鼠5 min內(nèi)的運(yùn)動距離和運(yùn)動速度,HPLC法檢測小鼠紋狀體微透析液中谷氨酸和GABA的濃度。結(jié)果:Ndrg2-/-小鼠運(yùn)動距離和運(yùn)動速度明顯高于WT鼠,表現(xiàn)為更大的興奮性(p0.01),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ndrg2-/-小鼠微透析液中谷氨酸濃度明顯高于WT組(p0.01),但GABA的含量沒有明顯的變化。注射LV-NDRG2恢復(fù)Ndrg2-/-小鼠NDRG2表達(dá)后,可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。結(jié)論:中樞神經(jīng)系統(tǒng)NDRG2的表達(dá)水平影響小鼠的興奮性,NDRG2缺失,小鼠表現(xiàn)為更高的興奮性,這種興奮性增高與腦組織細(xì)胞外液主要的興奮性氨基酸-谷氨酸含量升高有關(guān)。第二部分NDRG2促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取目的:觀察NDRG2對星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸能力的影響。方法:分離純化WT及Ndrg2-/-原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞用LV-NDRG2或LV-Ctrl轉(zhuǎn)染。用含200μM FITC-谷氨酸的DMEM培養(yǎng)基作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)間(0、5 min、30 min、60 min、120 min),共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果:在不同時(shí)間點(diǎn)(5 min、30 min、60 min、120 min)Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯低于WT組(p0.01),Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取能力,無論量還是速度都出現(xiàn)明顯的減低(p0.01)。用LV-NDRG2轉(zhuǎn)染Ndrg2-/-原代星形膠質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)NDRG2的表達(dá),與LV-Ctrl組相比,星形膠質(zhì)細(xì)胞對FITC-谷氨酸的攝取能力得以恢復(fù)。結(jié)論:NDRG2促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸。第三部分NDRG2促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞Na~+依賴性的谷氨酸攝取目的:探討NDRG2影響星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸的可能機(jī)制。方法:分離純化WT及Ndrg2-/-原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞用LV-NDRG2或LV-Ctrl轉(zhuǎn)染。Na~+/K~+-ATPase檢測試劑盒檢測細(xì)胞Na~+/K~+-ATPase的活性,Coro Na檢測細(xì)胞內(nèi)Na~+濃度。Western blot檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞NDRG2、EAAT1、EAAT2、Na~+/K~+-ATPaseα1、Na~+/K~+-ATPaseβ1的表達(dá)變化。結(jié)果:與WT星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞Na~+/K~+-ATPase活性明顯降低(p0.05),細(xì)胞內(nèi)Na~+熒光強(qiáng)度明顯升高(p0.01),Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT1、EAAT2和Na~+/K~+-ATPaseβ1表達(dá)明顯降低(p0.01),而Na~+/K~+-ATPaseα1的表達(dá)沒有變化。用LV-NDRG2轉(zhuǎn)染Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)NDRG2表達(dá)后,可以逆轉(zhuǎn)上述變化。結(jié)論:NDRG2增強(qiáng)Na~+/K~+-ATPase活性,降低細(xì)胞內(nèi)Na~+濃度,促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT1、EAAT2和Na~+/K~+-ATPaseβ1的表達(dá),促進(jìn)Na~+-依賴性的谷氨酸攝取,從而發(fā)揮保護(hù)作用。第四部分NDRG2通過與Na~+/K~+-ATPase相互作用調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取目的:探討NDRG2影響星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸的分子靶點(diǎn)。方法:從WT及Ndrg2-/-小鼠分離、純化星形膠質(zhì)細(xì)胞。LV-β1或LV-Ctrl轉(zhuǎn)染Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基表達(dá),Western blot檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞NDRG2、EAAT1、EAAT2、Na~+/K~+-ATPaseα1、Na~+/K~+-ATPaseβ1的表達(dá)變化,共聚焦顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞對FITC-谷氨酸的攝取能力。免疫共沉淀的方法確定NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基是否存在相互作用。阻斷NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基的相互作用,檢測對星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取FITC-谷氨酸能力的影響,并檢測細(xì)胞Na~+/K~+-ATPase活性及細(xì)胞內(nèi)Na~+濃度結(jié)果:當(dāng)我們用LV-β1轉(zhuǎn)染Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基的表達(dá)后,與LV-Ctr組相比,EAAT1和EAAT2表達(dá)上調(diào)(p0.01),而Na~+/K~+-ATPaseα1的表達(dá)沒有變化,星形膠質(zhì)細(xì)胞對FITC-谷氨酸的攝取能力明顯增加(120 min時(shí),與Ndrg2-/-~+LV-Ctrl組相比,p0.01)。通過免疫共沉淀的方法,我們確定NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基存在相互作用。阻斷NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基的相互作用,星形膠質(zhì)細(xì)胞對FITC-谷氨酸的攝取能力明顯降低(p0.01),細(xì)胞內(nèi)Na~+/K~+-ATPase活性降低(p0.05)、細(xì)胞內(nèi)Na~+濃度升高(p0.01)。結(jié)論:NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基存在相互作用。上調(diào)Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基的表達(dá)及增強(qiáng)Na~+/K~+-ATPaseβ1同NDRG2的相互作用,能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞Na~+依賴性的谷氨酸攝取。第五部分NDRG2通過促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取降低谷氨酸對神經(jīng)元的興奮毒性損傷目的:觀察NDRG2通過促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取降低對神經(jīng)元的興奮毒性損傷方法:星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元建立直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)體系。直接共培養(yǎng)體系中,檢測谷氨酸對神經(jīng)元NMDAR1膜轉(zhuǎn)位的影響。間接共培養(yǎng)體系中,用含200μM谷氨酸的培養(yǎng)基共培養(yǎng)120 min后,檢測谷氨酸濃度,神經(jīng)元用不含谷氨酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,檢測LDH釋放率和神經(jīng)元死亡率。阻斷NDRG2與Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基相互作用后,觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力的變化及谷氨酸對神經(jīng)元興奮毒性的影響。結(jié)果:在直接共培養(yǎng)體系中,與WT共培養(yǎng)組相比,Ndrg2-/-共培養(yǎng)組神經(jīng)元NMDAR1膜轉(zhuǎn)位明顯增加,神經(jīng)元胞體及突起NMDAR1明顯增加。間接共培養(yǎng)體系中,與WT星形膠質(zhì)細(xì)胞組相比,Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中谷氨酸、LDH明顯升高(p0.01),神經(jīng)元死亡率是明顯增加(p0.01)。用LV-NDRG2轉(zhuǎn)染Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)NDRG2表達(dá)后,可以逆轉(zhuǎn)上述變化。阻斷NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亞基相互作用后,星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取能力降低,加重對神經(jīng)元的興奮毒性損傷。結(jié)論:NDRG2通過與Na~+/K~+-ATPaseβ1相互作用促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸,抑制神經(jīng)元表面NMDAR1移位,減輕谷氨酸對神經(jīng)元的毒性損傷,從而發(fā)揮保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R338

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本文編號：1645895