發(fā)布時(shí)間：2018-03-21 22:21

  本文選題：鼠傷寒沙門菌　切入點(diǎn)：自噬　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自噬是真核生物進(jìn)化上相對保守的細(xì)胞內(nèi)代謝過程,其主要功能是清除受損細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白以及入侵的病原菌。自噬始于雙層膜囊泡自噬小體的產(chǎn)生,其不斷延伸包圍周圍細(xì)胞質(zhì)成分和細(xì)胞器,最終通過與溶酶體的融合降解底物從而實(shí)現(xiàn)小分子的循環(huán)再利用。自噬以非選擇性和選擇性兩種方式降解底物。自噬作為天然免疫的一部分保護(hù)細(xì)胞受損。自噬的調(diào)控機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),mTOR和AMPK兩個(gè)激酶在自噬中起重要重要。mTOR是自噬的負(fù)調(diào)控分子并發(fā)揮“門衛(wèi)”作用。AMPK被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的開關(guān),細(xì)胞自噬的感受器。AMPK和mTOR分別感知能量壓力和營養(yǎng)物質(zhì)消耗。AMPK通過上游的LKB1激活。本實(shí)驗(yàn)室的最近研究發(fā)現(xiàn),TAK1,也能激活A(yù)MPK。AMPK磷酸化ULK1 S555位點(diǎn)并激活ULK1。mTOR與多個(gè)互作蛋白結(jié)合形成mTOR復(fù)合體1(mTORC1),mTORC1可磷酸化ULK1/2 S757位點(diǎn)從而抑制其活性。營養(yǎng)缺乏或mTOR抑制劑雷帕霉素抑制mTORC1活性激活ULK1并誘導(dǎo)自噬。自噬作為細(xì)胞抵抗胞內(nèi)病原菌的第一道防線,與天然免疫協(xié)同作用,共同抵御細(xì)菌入侵,在病理生理學(xué)上具有重要意義。鼠傷寒沙門菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,該菌是引起腸炎的最常見的沙門菌。沙門菌入侵胞內(nèi)后形成沙門菌囊泡(Salmonella containing vesicle,SCV)并在其內(nèi)增殖。部分囊泡由于沙門菌釋放的Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白導(dǎo)致囊泡的胞膜受損,細(xì)菌進(jìn)入胞漿后激活選擇性自噬。但沙門菌激活自噬的機(jī)理并不是很清楚,特別是AMPK和mTOR兩個(gè)重要的調(diào)控自噬的激酶是調(diào)控沙門菌誘導(dǎo)的自噬存在很大的爭議。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和人宮頸癌HeLa細(xì)胞系為模式細(xì)胞,研究鼠傷寒沙門菌能否誘導(dǎo)自噬發(fā)生,探究自噬發(fā)生的機(jī)制以及自噬在鼠傷寒沙門菌胞內(nèi)增殖中的作用。首先,我們利用Western blot技術(shù)對鼠傷寒沙門菌感染下的RAW264.7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的LC3和p62的表達(dá)情況進(jìn)行檢測;利用共聚焦顯微鏡觀察自噬是否可以靶向入侵的鼠傷寒沙門菌,即紅色熒光細(xì)菌是否與GFP-LC3共定位;對鼠傷寒沙門菌以及自噬抑制劑氯喹(CQ)和巴弗洛霉素(bafilomycin A1)處理的HeLa細(xì)胞中的LC3表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,鼠傷寒沙門菌增加RAW264.7和HeLa細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值但降低p62的表達(dá)水平;CQ和bafilomycin A1能進(jìn)一步增加鼠傷寒沙門菌作感染后的LC3-II/LC3-I比值;GFP-LC3與RFP標(biāo)記的鼠傷寒沙門菌在HeLa細(xì)胞中共定位。這些結(jié)果表明自噬的確可以靶向入侵的鼠傷寒沙門菌。其次,我們利用Western blot技術(shù)檢測了不同MOI鼠傷寒沙門菌感染不同時(shí)間下與自噬相關(guān)的信號通路中的蛋白磷酸化水平(AMPK、ULK、mTOR、S6K1、S6),檢測了 AMPK抑制劑Compound C和TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol預(yù)處理鼠傷寒沙門菌作用下細(xì)胞AMPK和ULK蛋白的磷酸化水平以及LC3和p62的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,鼠傷寒沙門菌抑制HeLa細(xì)胞中但增加了 RAW264.7細(xì)胞中mTOR、S6K1和S6蛋白的磷酸化。鼠傷寒沙門菌增加RAW264.7和HeLa細(xì)胞中AMPKT172的磷酸化。鼠傷寒沙門菌增加了 RAW264.7細(xì)胞但抑制了 HeLa細(xì)胞中ULKs555的磷酸化,Compound C與5Z-7-oxozeaenol可抑制鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)的RAW247.6細(xì)胞中AMPK和ULK的磷酸化。最后,我們利用菌落計(jì)數(shù)法對AMPK在鼠傷寒沙門菌自噬中的作用進(jìn)行評估。結(jié)果顯示,AMPK抑制劑Compound C的加入可以短暫地增加細(xì)菌在HeLa細(xì)胞內(nèi)的增殖能力,表明細(xì)胞能夠通過AMPK誘導(dǎo)的自噬清除胞內(nèi)的鼠傷寒沙門菌。綜上所述,鼠傷寒沙門菌在RAW264.7細(xì)胞中主要通過磷酸化激活A(yù)MPK-ULK誘導(dǎo)自噬,而在HeLa細(xì)胞中,鼠傷寒沙門菌可通過抑制mTOR磷酸化和增加AMPK磷酸化來誘導(dǎo)自噬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R378
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本文編號：1645825