本文選題：microRNA　切入點(diǎn)：巨噬細(xì)胞　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：micro RNA(mi RNA)是一種由21-25個(gè)堿基組成的非編碼單鏈核苷酸序列,通過(guò)特異性結(jié)合m RNA從而抑制其翻譯過(guò)程。mi RNA通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)的合成從而參與調(diào)控幾乎所有的細(xì)胞代謝,甚至很多疾病的發(fā)生也與mi RNA有密切關(guān)系。目前mi RNA的臨床應(yīng)用也在逐漸被開發(fā),之前的研究表明,mi RNA檢測(cè)在疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷上具有重要價(jià)值。如,mi R-21在惡性腫瘤中普遍升高,對(duì)腫瘤具有較高的診斷和判斷預(yù)后作用;mi R-155在B細(xì)胞淋巴瘤中明顯上升,mi R-155基因位點(diǎn)的突變可做為B細(xì)胞淋巴瘤的檢測(cè)指標(biāo);抑制活體內(nèi)mi R-126水平可明顯減輕哮喘癥狀,說(shuō)明其在哮喘中的治療價(jià)值。雖然mi RNA的研究?jī)H有幾十年的歷史,但它們?yōu)榧膊〉陌l(fā)生、診斷、治療等方面的作用已被大量開發(fā)。探討各種mi RNA在細(xì)胞中的作用和機(jī)制也成為一門重要的學(xué)科。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)及其關(guān)鍵的組成部分,參與先天免疫和適應(yīng)性免疫,在對(duì)抗外來(lái)病原體、參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)方面發(fā)揮重要作用。研究認(rèn)為,多種疾病的發(fā)生都與巨噬細(xì)胞有密切關(guān)系:由于巨噬細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫和防御反應(yīng)方面具有重要功能,缺乏會(huì)導(dǎo)致抵抗下降,使機(jī)體發(fā)生感染的機(jī)會(huì)大大增加;M2型巨噬細(xì)胞主要可激活Th2相關(guān)疾病如哮喘等,還對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用;同時(shí)巨噬細(xì)胞在脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮重要作用,巨噬細(xì)胞攝取修飾低密度脂蛋白過(guò)多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積,向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化,發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。mi RNA作為近十幾年來(lái)興起的一種調(diào)控因子,在巨噬細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用,mi RNA通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的合成,從而調(diào)控巨噬細(xì)胞功能。然而,盡管之前有很多研究發(fā)現(xiàn)mi RNA在巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝中具有重要作用,但很少有研究從起源上探討巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)的mi RNA。目前廣泛認(rèn)為,組織巨噬細(xì)胞的更新主要來(lái)源于骨髓前體細(xì)胞的分化,巨噬細(xì)胞的分化異常會(huì)導(dǎo)致正常巨噬細(xì)胞數(shù)目下降或功能異常,從而誘導(dǎo)相關(guān)疾病的發(fā)生。探索mi RNA在骨髓細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化中的工作網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制引起了我們的興趣。因此,從眾多mi RNA中篩選出與巨噬細(xì)胞分化相關(guān)的mi RNA成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)microarray技術(shù)從上千種mi RNA中篩選出與巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)的mi RNA,并分析這些mi RNA與巨噬細(xì)胞成熟、免疫炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝等功能相關(guān)分子之間的關(guān)系,構(gòu)建mi RNA在這些巨噬細(xì)胞中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從理論上篩選出參與巨噬細(xì)胞分化和功能的mi RNA及其相關(guān)分子通路,我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將會(huì)進(jìn)一步驗(yàn)證這些理論通路。該實(shí)驗(yàn)是首次分析巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中的mi RNA工作網(wǎng)絡(luò),并篩選出大量之前未被發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞功能相關(guān)mi RNA,并提出mi RNA調(diào)控的分子通路假說(shuō),具有重要的研究?jī)r(jià)值。實(shí)驗(yàn)方法:1.選取6-8周野生型BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分離骨髓細(xì)胞后應(yīng)用巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化,第3、5、7天收集細(xì)胞,Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài),FACS測(cè)定巨噬細(xì)胞比例,細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)量細(xì)胞的數(shù)目;2.提取細(xì)胞m RNA,用microarray方法檢測(cè)骨髓細(xì)胞和第3、5、7天巨噬細(xì)胞的mi RNA表達(dá)水平;篩選表達(dá)變化最明顯的mi RNA,通過(guò)Target Scan分析這些mi RNA的靶基因,并用Me SH數(shù)據(jù)庫(kù)分析這些mi RNA調(diào)控的與巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)和功能有關(guān)的靶分子,通過(guò)Venn圖找出這兩種方法所得分子的重疊部分;3.將上述參與巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)功能的mi RNA靶標(biāo)進(jìn)行分析,通過(guò)Ingenuity Pathways Analysis(IPA)系統(tǒng)研究這些分子參與的巨噬細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路,以及與巨噬細(xì)胞關(guān)鍵性分子密切相關(guān)的mi RNA。并總結(jié)具有多功能的mi RNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.FACS結(jié)果發(fā)現(xiàn),分化第3、5、7天收集的貼壁細(xì)胞中巨噬細(xì)胞百分比分別為92.2%、96%、99%。Gimsa染色示巨噬細(xì)胞從第3到7天巨噬細(xì)胞成熟過(guò)程中逐步發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示骨髓細(xì)胞、第3、5、7天巨噬細(xì)胞濃度呈明顯上升趨勢(shì)。2.共有112種mi RNA在巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)生明顯變化,即上調(diào)或下調(diào)5倍以上。在第3天,56種mi RNA表達(dá)下降而58種mi RNA表達(dá)升高。第5天和第7天,66種mi RNA降低而48種mi RNA升高。3.Target Scan和Me SH軟件發(fā)現(xiàn),上述112種mi RNA共有8367種靶標(biāo)分子,其中1267種靶標(biāo)分子參與巨噬細(xì)胞的分化和功能,IPA分析發(fā)現(xiàn)這1267種分子與30種巨噬細(xì)胞經(jīng)典信號(hào)通路密切相關(guān)。如HGF、IL-6、NGF等通路參與調(diào)控細(xì)胞的生存和凋亡,糖皮質(zhì)激素受體、NF-κB,RANK等通路是巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)通路。4.通過(guò)加入mi Randa和Ingenuity Pathways Analysis(IPA)分析系統(tǒng),進(jìn)一步研究這112種mi RNA與巨噬細(xì)胞關(guān)鍵性功能分子的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)18種mi RNA可能參與調(diào)節(jié)CSF1R,CD36,MSR1和SCARB1這四種巨噬細(xì)胞相關(guān)受體;7種mi RNA與轉(zhuǎn)錄因子RUNX1和PU.1的調(diào)節(jié)有關(guān);14種mi RNA與PPARα和PPARγ的m RNA有潛在的結(jié)合位點(diǎn);17種mi RNA與TLR2、3、4、7、13這幾種受體的調(diào)節(jié)有關(guān)。5.通過(guò)分析上述生物信息軟件發(fā)現(xiàn)的與巨噬細(xì)胞關(guān)鍵性分子相關(guān)的mi RNA,我們發(fā)現(xiàn)mi R-155、mi R-18b、mi R-542-3p、mi R-152、mi R-129-5p、mi R-130a這6種mi RNA分別調(diào)控4種巨噬細(xì)胞分子;mi R-141和mi R-221這兩種mi RNA分別調(diào)控3種分子,mi R-24、mi R-150、mi R-22、mi R-34a、mi R-326、mi R-363、mi R-27b、mi R-101a、mi R-144、mi R-181c這10種mi RNA參與調(diào)控兩種分子。這些多功能mi RNA,尤其是調(diào)控4種巨噬細(xì)胞分子的6種mi RNA在以后研究巨噬細(xì)胞分化和功能中具有重要價(jià)值。結(jié)論:1.本研究用microarray的方法篩選出在骨髓巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中明顯變化的mi RNA,并通過(guò)Target Scan和Me SH等軟件篩選出這些mi RNA的靶標(biāo)中與巨噬細(xì)胞分化和功能有關(guān)的分子,以及這些靶標(biāo)分子參與的信號(hào)通路。2.通過(guò)Target Scan、Mi Randa、IPA等軟件分析上述mi RNA以及巨噬細(xì)胞關(guān)鍵性分子如MSR1、CD36、SCRAB1、CSF1R、RUNX1、PU.1、PPARα、PPARγ、TLR2、TLR3、TLR4、TLR13和TLR7,篩選與這些分子相關(guān)的mi RNA,構(gòu)建相應(yīng)的mi RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3.通過(guò)討論分析,確定了具有重要研究?jī)r(jià)值的mi RNA及其參與調(diào)控的分子和功能,我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證這些通路,發(fā)掘出更多的巨噬細(xì)胞相關(guān)mi RNA,為以后研究巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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