本文選題：Kif2a　切入點：小鼠卵母細胞減數(shù)分裂　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的和意義:Kif2a作為微管解聚酶,在有絲分裂中的雙極紡錘體的形成,染色體聯(lián)會與分離,紡錘體極聯(lián)合中起到重要作用。到目前為止,Kif2a是否參與減數(shù)分裂過程中調(diào)節(jié)紡錘體組裝、染色體運動及分離等仍未知。本研究中,我們研究了 Kif2a在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中表達、定位和功能。方法:取6-8周ICR雌性小鼠的GV期卵母細胞體外培養(yǎng);首先對各期卵母細胞進行免疫印跡檢測Kif2a蛋白表達、免疫熒光檢測Kif2a定位;接著用免疫熒光試驗檢測Taxol和Nocodazole處理后的中期卵母細胞,以明確Kif2a與微管動力的關系;對卵母細胞進行Kif2asiRNA顯微注射,抑制其蛋白表達后采用染色體鋪片、冷處理、免疫熒光、免疫印跡等方法研究其在減數(shù)分裂成熟中具體作用。三次獨立重復的實驗用平均數(shù)±標準差表示。用SPSS 17.0軟件進行差異分析,采用獨立樣本T檢驗。P0.05被定義為差異有顯著統(tǒng)計學意義。用ZEN(2012)軟件進行熒光強度數(shù)據(jù)分析。實驗結果:一、Kif2a作為微管解聚酶調(diào)節(jié)減數(shù)分裂紡錘體的組裝和染色體排列Western blot結果示:Kif2a在減數(shù)分裂成熟各時期均有表達,GV期表達水平較低,從GV期到MⅠ期逐漸上升,MⅡ期有所下降。免疫熒光顯示:GV期Kif2a定位于生發(fā)泡內(nèi)。GVBD后,Kif2a聚攏于染色體周圍,且染色體著絲粒上檢測到較弱信號。MⅠ期和MⅡ期,Kif2a主要定位于紡錘體,并于紡錘體兩極及染色體著絲粒處富集。TⅠ期,Kif2a富集于細胞中體上。染色體鋪片顯示,MⅠ期和MⅡ期Kif2a信號位于染色體內(nèi)著絲粒處。Taxol處理后,紡錘體微管蛋白高度聚集,并在胞內(nèi)形成大量胞質(zhì)星體。免疫熒光發(fā)現(xiàn),Kif2a信號和α-tubulin信號出現(xiàn)重疊,且高度集中在異常的紡錘體極、胞質(zhì)星體和著絲粒上。以上定位提示,Kif2a可能參與調(diào)控紡錘體組裝和染色體運動。利用siRNA干擾Kif2a表達后,導致紡錘體嚴重缺陷(大多數(shù)為無極、單極,其次為多極和變寬的紡錘體);影響卵母細胞紡錘體向皮質(zhì)遷移;并出現(xiàn)染色體排列異常(延遲分裂和完全排列異常的染色體)。γ-tubulin作為MTOC相關蛋白,是參與減數(shù)分裂中微管成束和紡錘體組裝的重要蛋白。在Kif2a降調(diào)組,γ-tubulin從紡錘體的兩極脫落且不規(guī)則散布于紡錘體微管或分散于胞漿中。由此推斷,Kif2a可能參與紡錘體極聚集。冷處理后,在Kif2a降調(diào)組MⅠ期卵母細胞紡錘體中的α-tubulin熒光強度較強,顯著高于對照組;說明Kif2a通過其微管解聚酶活性,發(fā)揮對微管的解聚作用,參與紡錘體組裝調(diào)節(jié)。二、Kif2a參與小鼠卵母細胞減數(shù)分裂進程調(diào)控降調(diào)Kif2a影響紡錘體組裝,引起小鼠卵母細胞第一次減數(shù)分裂Pro-MⅠ/MⅠ期阻滯、第一極體排出率下降、大極體排出率增加。我們進一步探究:染色體是否可以發(fā)生正確分離。染色體鋪片發(fā)現(xiàn),實驗組同源染色體未分離;而對照組同源染色體已經(jīng)分離,提示減數(shù)分裂已進入后期完成階段。接下來研究了紡錘體檢驗點(SAC)的重要成分Bub3的分布。Kif2a降調(diào)組卵母細胞即使培養(yǎng)10小時,仍阻滯于Pro-MⅠ/MⅠ期,并在染色體上檢測到Bub3信號,提示SAC被激活;而對照組卵母細胞進入AI期,且未檢測到Bub3信號。CyclinB1的降解和MPF活性缺失是卵母細胞突破MI期進入后期的必要條件。我們將Kif2a降調(diào)組和對照組卵母細胞培養(yǎng)10小時,對CyclinB1進行免疫印跡檢測。Kif2a降調(diào)后,CyclinB1水平較對照組顯著升高,提示:Kif2a降調(diào)引起CyclinB1降解異常,從而引起中/后期轉(zhuǎn)化受阻。將Kif2a降調(diào)組和對照組細胞培養(yǎng)8.5小時后進行鬼筆環(huán)肽-FITC染色發(fā)現(xiàn),對照組染色體位于細胞邊緣且檢測到微絲帽形成。Kif2a降調(diào)組染色體位于細胞中央,未檢測到微絲帽形成�？梢奒if2a敲減引起微絲帽形成受損。結論:我們研究結果顯示:Kif2a可能作為微管解聚酶和微管組織中心相關蛋白,在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中紡錘體的組裝與遷移、染色體排列、微絲帽形成和第一極體排出中起到重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R321

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