本文選題：NK細(xì)胞　切入點(diǎn)：程序性分化　出處：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是固有免疫系統(tǒng)中的一種重要細(xì)胞,在抗病毒、抗腫瘤過程中發(fā)揮著重要作用。在造血干細(xì)胞移植過程中,NK細(xì)胞是最早出現(xiàn)的免疫細(xì)胞,發(fā)揮著重要的抗白血病細(xì)胞效應(yīng),而且不會(huì)引發(fā)機(jī)體移植物抗宿主病。因此,NK細(xì)胞在白血病過繼轉(zhuǎn)輸治療方面具有重要的應(yīng)用前景。體外擴(kuò)增大量功能性NK細(xì)胞并獲得有效的治療效果是目前NK細(xì)胞臨床應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。就這些問題,我們進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn),得到以下結(jié)果:1、通過采用臍血CD34+干細(xì)胞,應(yīng)用不同的細(xì)胞因子組合使其最終分化為NK細(xì)胞。經(jīng)過五周的培養(yǎng),NK細(xì)胞的比例可達(dá)到90%以上,擴(kuò)增約7000倍。通過對(duì)不同階段培養(yǎng)細(xì)胞差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類及相關(guān)性分析,我們發(fā)現(xiàn)前三周細(xì)胞和后兩周細(xì)胞之間的基因表達(dá)有明顯不同,根據(jù)這一現(xiàn)象,我們將NK細(xì)胞的體外分化過程分別命名為程序一和程序二。2、對(duì)已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)程序二的細(xì)胞與原代NK細(xì)胞具有相似的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜,表明所培養(yǎng)的細(xì)胞可以作為研究NK細(xì)胞發(fā)育分化的體外模型。進(jìn)而對(duì)兩個(gè)分化階段的細(xì)胞進(jìn)行差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子分析,我們發(fā)現(xiàn)程序一的細(xì)胞主要聚集鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,而程序二的細(xì)胞主要聚集基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)域家族和螺旋-轉(zhuǎn)向-螺旋結(jié)構(gòu)域家族的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析,表明程序一為NK細(xì)胞前體,程序二調(diào)控NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及功能成熟。3、對(duì)不同階段培養(yǎng)細(xì)胞的趨化因子受體及細(xì)胞因子受體表達(dá)譜進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)程序二,即分化的NK細(xì)胞表達(dá)相對(duì)高水平的NK細(xì)胞功能相關(guān)受體,表明此細(xì)胞具有發(fā)揮相應(yīng)NK細(xì)胞活化及殺傷功能的潛能。4、隨后我們對(duì)不同階段細(xì)胞殺傷性分子的表達(dá)進(jìn)行分析檢測(cè),同樣發(fā)現(xiàn)分化的NK細(xì)胞表達(dá)更高水平的炎性細(xì)胞因子及殺傷相關(guān)的功能分子,并且該細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷活性。5、對(duì)所做的芯片進(jìn)行深層次的挖掘,我們發(fā)現(xiàn)分化的NK細(xì)胞表達(dá)大量的SLAM家族的受體,包括CD244、CD48、CRACC和NTBA。具有較強(qiáng)殺傷功能的外周血NK及臍帶血NK細(xì)胞高表達(dá)以上的SLAM家族受體。并且,培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)有SAP和EAT-2,確保SLAM家族受體可以傳遞活化性信號(hào)。6、通過RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系相較于實(shí)體瘤細(xì)胞系,表達(dá)更高水平的SLAM家族對(duì)應(yīng)配體,CD48、CD244、CRACC和NTBA。同樣的,臨床白血病病人的白血病細(xì)胞也有相應(yīng)配體的表達(dá),提示NK細(xì)胞可通過SLAM家族受配體的相互作用更有效殺傷白血病細(xì)胞。7、應(yīng)用過表達(dá)或干擾SLAM家族配體的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合和殺傷實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)SLAM家族受配體的相互作用可以促進(jìn)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合及促進(jìn)其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。對(duì)臨床白血病病人SLAM家族配體的表達(dá)水平與NK細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞上SLAM家族配體表達(dá)水平越高,NK細(xì)胞的殺傷能力越強(qiáng)。結(jié)合上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們建立了一個(gè)體外大規(guī)模分化擴(kuò)增NK細(xì)胞的體系,并且發(fā)現(xiàn)在NK細(xì)胞的發(fā)育分化過程中,無論在轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞受體及功能方面都有明顯的分區(qū),存在一種程序性的分化模式。對(duì)分化的NK細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其表面表達(dá)較高水平的SLAM家族受體,與之相對(duì)應(yīng)的白血病細(xì)胞上表達(dá)相應(yīng)的配體,并且該受配體的存在可明顯增強(qiáng)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合,及促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。上述結(jié)果提示NK細(xì)胞在白血病過繼轉(zhuǎn)輸中有更好的治療效果,并且白血病細(xì)胞表面SLAM家族配體的表達(dá)可作為NK細(xì)胞治療有效性的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。
[Abstract]:Natural killer cells (NK cells) is a kind of important cells in the innate immune system plays an important role in antiviral and antitumor process. After hematopoietic stem cell transplantation in NK cells is the earliest immune cells play an important effect of anti leukemia cells, but not cause the body graft host disease. Therefore, it has important application prospect of NK cell transfusion therapy in the treatment of leukemia. A large number of adoptive in vitro functional NK cells and obtain effective treatment is currently a hot research and clinical application of NK cells. These problems, we have done experiments, we obtained the following results: 1, through the use of umbilical cord blood CD34+ stem cells, using different cytokine combinations which eventually differentiate into NK cells. After five weeks of incubation, the proportion of NK cells can reach more than 90%, was about 7000 times. Through the different stages of fine culture Clustering analysis and correlation of cell differentially expressed genes, we found the expression between three weeks before and two weeks after cell genes are significantly different, according to this phenomenon, we will in vitro differentiation of NK cells are named for the program and procedures to detect two.2 transcription factors have been reported, found that cell program two and primary NK cells with similar transcription factor expression profiles show that the cultured cells can be used as an in vitro model of NK cell development and differentiation. Then the two stages of differentiation cell factor analysis of differentially expressed transcripts, we found a main program of cell aggregation of zinc finger transcription factor domain the two main program, cell aggregation based domain family and helix turn helix domain transcription factor family of transcription factors. The corresponding analysis shows that a program for NK cell The precursor, NK cell transformation and function control program of two mature.3, in different stages of cultured cells of chemokine receptor and cytokine receptor expression spectrum analysis, we found that the two program, the differentiation of NK cells and NK cells express high levels of relative function related receptor, shows that the cell has played the corresponding activation of NK cells and the cytotoxicity of potential.4, then we in different stages of the molecular expression of cell killing was detected, also found that the differentiation of NK cells and the expression of inflammatory cytokines and higher levels of cytotoxicity of related molecules, and the cells have strong cytotoxic activity of.5, deep mining to do the chip, we found the expression of a large number of SLAM family receptors, differentiated NK cells including CD244, CD48, CRACC and NTBA. have strong killing function of NK in the peripheral blood and umbilical cord blood NK cells with high expression The receptors of the SLAM family. And, the cultured cells expressed SAP and EAT-2, to ensure that the SLAM family receptors can transfer activation signals of.6, were detected by RT-PCR and flow cytometry, we found that tumor cells in blood system compared to the solid tumor cell lines, expression of SLAM family corresponding ligands, higher levels of CD48 CD244, CRACC and NTBA. in the same patient, clinical leukemia leukemia cells have the expression of the corresponding ligand, suggesting that the interaction of NK cells through the SLAM receptor ligand family more effective anti leukemia cell.7, application of overexpression or interference of ligands of the SLAM family cell binding and cytotoxicity assay, we found that the interaction of SLAM family by the ligand can promote the combination of NK and target cells and promote it to kill target cells. The expression level of SLAM in patients with leukemia family ligand NK cells can Force testing, found in leukemia cells SLAM family ligand expression level is higher, NK cell killing ability. According to the experimental results above, we established an in vitro differentiation of NK cell mass amplification system, and found in the development and differentiation of NK cells, both in transcription factors, cell receptors and function there are obvious partition, there is a procedural differentiation model. On the differentiation of NK cells were detected and found higher levels of SLAM receptor expression on the surface of the family, and the expression of the corresponding ligand corresponding to the leukemia cells, and the presence of ligand can significantly enhance the binding of NK cells and target cells, and promote the cytotoxicity of NK cells against target cells. These results suggest that NK cells have a better therapeutic effect in the transmission of leukemia and adoptive, leukemia cell surface ligands of the SLAM family table as an Potential predictors for the effectiveness of NK cell therapy.

【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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