本文選題：阿爾茨海默病　切入點(diǎn)：Aβ42　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種原發(fā)性神經(jīng)退行性病變,其病理學(xué)特征為淀粉樣蛋白(Amyliod-protein,Aβ)沉積形成老年斑(senile plaques, SPs)、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)以及特有的中樞膽堿能神經(jīng)元的大量死亡及丟失等。大腦內(nèi)的Aβ的產(chǎn)生和降解機(jī)制失衡是現(xiàn)在比較公認(rèn)的阿爾茨海默癥的發(fā)病機(jī)制。中藥復(fù)方的研究雖然有多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢(shì),但不能清楚說(shuō)明參與疾病機(jī)制調(diào)控的作用靶點(diǎn),而中藥單體研究的優(yōu)勢(shì)則更加突顯。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿爾茨海默病最主要的發(fā)病機(jī)制與腎虛有關(guān)。因此,本實(shí)驗(yàn)選取臨床常用的補(bǔ)腎要藥的有效單體成分——巴戟甲素(巴戟天提取物),女貞苷(女貞子提取物),淫羊藿苷(淫羊藿提取物)進(jìn)行篩選,并探討對(duì)AD模型的有保護(hù)作用的補(bǔ)腎單體的可能作用機(jī)制。方法1.篩選淀粉樣蛋白Aβ42對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞最佳的損傷濃度,然后建立穩(wěn)定的細(xì)胞損傷模型。2.分別在小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和SH-SY5Y細(xì)胞上篩選出補(bǔ)腎中藥單體巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷合適的作用濃度,并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,從以上三種中藥單體中篩選出對(duì)A β 42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性有保護(hù)作用的單體。4.選擇有效的補(bǔ)腎中藥單體,對(duì)其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討。4.1巴戟甲素對(duì)AD模型保護(hù)作用的機(jī)制探討4.1.1巴戟甲素對(duì)Aβ 42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制探討：巴戟甲素作用于細(xì)胞12h,免疫印跡法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞低密度脂蛋白受體1(LRP1),淀粉樣前體蛋白(APP)的影響,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞LRP1 mRNA表達(dá)的變化。巴戟甲素分別作用于正常的SH-SY5Y細(xì)胞和Si LRP1 SH-SY5Y細(xì)胞后,加入Aβ42,用Elisa法分別檢測(cè)胞內(nèi)胞外的Aβ42變化水平,激光共聚焦觀察隨時(shí)間變化Aβ42進(jìn)入細(xì)胞及與溶酶體共定位的情況。4.1.2巴戟甲素對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的影響：選擇7月齡的SPF級(jí)雄性APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠58只(品系名稱(chēng)：B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J(簡(jiǎn)稱(chēng)：APPSWe/PS1dE9),相同背景的非轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6J。雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、巴戟甲素低劑量(20mg/kg)組、巴戟甲素高劑量(80mg/kg)組,每組10只；同背景非轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠作為野生對(duì)照組,每組10只；灌胃處理1個(gè)月。給藥結(jié)束后取小鼠海馬組織,用Western blot檢測(cè)其LRP1的表達(dá)。4.2女貞苷對(duì)A β 42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制探討：女貞苷作用SH-SY5Y細(xì)胞后加入Aβ42,用Elisa法檢測(cè)胞外的Aβ42含量,免疫印跡法檢測(cè)NF-KB, Bcl-2,LC3蛋白變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.使用不同濃度的Aβ42 (5μmol·L-1、10μmol·L-1、15μmol·L-1、20μmol·L-1、40 μmol·L-1)損傷SH-SYSY細(xì)胞,各組細(xì)胞活力均降低,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。但5μmol·L-1、10μmol·L-1損傷SH-SYSY細(xì)胞的作用不夠強(qiáng),15μmol·L-1、20μmol·L-1、 40μmol·L-1均可以損傷的條件下,則選擇最小劑量的15μmol·L-1 Aβ42作為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2.在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y上篩選巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷合適的用藥濃度,結(jié)果表明巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷濃度達(dá)到500μmol·L-1時(shí),對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(P0.05)。將巴戟甲素、女貞苷再次作用于更為敏感小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行篩選,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明巴戟甲素、女貞苷濃度小于500μmol·L-1時(shí),對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力亦無(wú)明顯影響(P0.05)。3.淫羊藿苷濃度為5、50、500μmol·L-1時(shí),對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明淫羊藿苷對(duì)該AD模型沒(méi)有明顯的保護(hù)作用,后續(xù)的機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)不予選取。4.巴戟甲素對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制探討4.1巴戟甲素的濃度為50、100、500μmol·L-1時(shí),對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷均有保護(hù)作用(P0.05)。4.2巴戟甲素保護(hù)作用初步的機(jī)制探討4.2.1巴戟甲素作用于SH-SY5Y細(xì)胞12h后,與正常組比較,巴戟甲素組(50、100μmol·L-1)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LRP1的蛋白表達(dá)明顯增加(P0.05),淀粉前體樣蛋白(APP)表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。Elisa檢測(cè)細(xì)胞胞內(nèi)及條件培養(yǎng)基中Aβ42的含量,結(jié)果顯示巴戟甲素可以有效增加SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)Aβ42的清除作用,與模型組條件培養(yǎng)基Aβ42含量比較,巴戟甲素(50、100μmol·L-1)組條件培養(yǎng)基的Aβ42含量相對(duì)減少(P0.05)；與模型組胞內(nèi)Aβ42含量比較,巴戟甲素組(50μmol·L-1)胞內(nèi)的Aβ42含量相對(duì)增加(P0.05),巴戟甲素組(100μmol·L-1)胞內(nèi)的Aβ42含量差異不明顯(P0.05)。激光共聚焦的結(jié)果顯示根據(jù)時(shí)間點(diǎn)的不同,在30 min時(shí)與對(duì)照組相比,巴戟甲素組中的A β 42進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞的較多。隨時(shí)間增加,在60min時(shí),巴戟甲素組內(nèi)吞A β 42多于模型組,但此時(shí)A β 42與溶酶體的無(wú)共定位。在120min時(shí),對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)少量的Aβ 42與溶酶體的共定位；與之相比,巴戟甲素組的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的A β 42與溶酶體的共定位要更多。4.2.2基因干擾LRP1進(jìn)行反向論證：巴戟甲素同時(shí)作用在正常的SH-SYSY細(xì)胞和SiLRP1的SH-SY5Y細(xì)胞上,Elisa檢測(cè)模型組、巴戟甲素組胞內(nèi)及條件培養(yǎng)基Aβ42的含量。結(jié)果顯示與模型組條件培養(yǎng)基比較,巴戟甲素組的條件培養(yǎng)基Aβ42的含量無(wú)明顯差異(P0.05)；與正常SH-SY5Y細(xì)胞模型組Aβ42的含量相比,Si LRP1的SH-SY5Y細(xì)胞胞外Aβ42含量明顯增高(P0.05)；與正常SH-SY5Y細(xì)胞巴戟甲素組比較,Si LRP1細(xì)胞的巴戟甲素組胞外Aβ42的含量也明顯增加(P0.05)�；虺聊M中的巴戟甲素的兩個(gè)用藥組和模型組相比,雖有降低的趨勢(shì),但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.2.3轉(zhuǎn)基因小鼠灌胃1月,取其海馬區(qū)的組織用Western blot法檢測(cè)其LRP1蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)巴戟甲素組的LRP1表達(dá)與正常組和模型組的蛋白表達(dá)并未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。5.女貞苷對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制探討5.1女貞苷的濃度為50、100μmol·L-1時(shí),對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的均有保護(hù)作用,可明顯增加細(xì)胞存活率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。顯微鏡下觀察Aβ42模型組與正常對(duì)照組細(xì)胞比較,正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好,樹(shù)枝狀軸突明顯,細(xì)胞透亮；模型組細(xì)胞形態(tài)邊緣模糊,細(xì)胞皺縮,軸突消失；與模型組比較,女貞苷兩個(gè)用藥組細(xì)胞凋亡明顯減少。5.2初步機(jī)制探討：女貞苷作用SH-SY5Y細(xì)胞后,Western blot檢測(cè)自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3,結(jié)果表明模型組LC3 JI/LC3 I相對(duì)表達(dá)量與正常組相比明顯增加(P0.05),與模型組相較,女貞苷組(50、100μmol·L-1)的LC3 Ⅱ/LC3 I比值明顯減少(P0.05)；NF-κB蛋白表達(dá)與模型組比較,檢測(cè)女貞苷組(50、100μmol·L-1)的明顯減少(P0.05),抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)則明顯增加(P0.05)。女貞苷同時(shí)也能增加SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)Aβ42的清除,Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示,與模型組條件培養(yǎng)基的Aβ42含量比較,女貞苷組(50、100μmol·L-1)的Aβ42含量均下降。結(jié)論：1.淫羊藿苷對(duì)Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性損傷沒(méi)有明顯保護(hù)作用。2.巴戟甲素可以保護(hù)Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性損傷,其可能機(jī)制是巴戟甲素作用于SH-SY5Y細(xì)胞可有效增加人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LRP1的表達(dá),增加細(xì)胞對(duì)Aβ42的轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)吞以及溶酶體對(duì)其清除,減少Aβ42在胞外的沉積從而降低Aβ42產(chǎn)生的細(xì)胞毒性,起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的海馬區(qū)卻未見(jiàn)LRP1蛋白表達(dá)明顯增加可能由于選擇的動(dòng)物模型與細(xì)胞模型作用機(jī)制不一致引起的。3.女貞苷可以保護(hù)Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性損傷,可以有效增加細(xì)胞對(duì)Aβ42的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除,對(duì)自噬有一定的抑制,抑制NF-κB的蛋白表達(dá)和增加抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá),可以起到保護(hù)神經(jīng)元的作用,抑制神經(jīng)元的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5;R-332

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