本文選題：神經(jīng)細胞分化發(fā)育　切入點：p300　出處：《華中科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：神經(jīng)發(fā)育是一個通過大量基因在時間和空間上非常精密地表達而被調(diào)控的復雜過程。這些基因的表達異常可導致神經(jīng)發(fā)育紊亂。染色質(zhì)結構能夠整合細胞內(nèi)、外環(huán)境的信息引發(fā)特定的表型產(chǎn)生,是一種調(diào)節(jié)基因精確表達的關鍵機制。組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases, HATs)是以空間和時間依賴性形式調(diào)控基因表達水平的蛋白家族之一,其通過乙�；揎椬饔每墒谷旧|(zhì)結構發(fā)生動態(tài)改變,并對基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應的影響。p300作為一種HAT,調(diào)控全身各組織中多種基因的轉(zhuǎn)錄活性,特別在細胞周期進程和細胞分化中發(fā)揮重要功能。除了具有乙酰轉(zhuǎn)移酶結構域,p300還含有許多保守功能結構域通過與其它細胞蛋白相互作用。p300的基本功能是作為HAT或FAT,以及充當轉(zhuǎn)錄因子和基本轉(zhuǎn)錄裝置中其它原件之間的三角架及橋架,易化染色質(zhì)重構并激活基因轉(zhuǎn)錄,能對神經(jīng)元中p53羧基末端特異賴氨酸位點乙�；龠M突起的生長并為軸突再生所必需。p300與另一種HAT即CREB結合蛋白(CREB-binding protein, CBP)非常相似,二者對細胞周期調(diào)控、凋亡、胚胎發(fā)育、細胞分化和腫瘤發(fā)生等多種活動都有影響,并是胚胎發(fā)育,特別是神經(jīng)發(fā)育中均是必不可少的調(diào)控因子。然而,二者也具有一些不同的功能,p300在神經(jīng)分化發(fā)育中的作用不能被CBP所替代。盡管p300在胚胎干細胞和畸胎瘤細胞F9細胞分化中必不可少,但是,在誘導胚胎干細胞擬胚胎形成的分化時,p300 mRNA水平升高但其蛋白水平下降：在視黃酸(retinoic acid, RA)誘導F9分化過程中,p300的HAT活性顯著增加,但其蛋白水平卻顯著降低,表明在分化過程中p300被大量降解。p300蛋白水平下降與泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解有關,但p300下降后伴隨的HAT活性增強促進細胞分化是否與泛素蛋白酶體系統(tǒng)途徑降解有關尚不確定。在急性髓性白血病中,CBP/p300發(fā)生降解,而鈣蛋白酶的特異性抑制劑能夠阻斷CBP/p300的下降,表明p300可被鈣蛋白酶降解。本研究在證明小鼠腦組織和小鼠成神經(jīng)瘤細胞(N2a細胞)分化發(fā)育過程中p300 mRNA表達逐漸增加而全長p300蛋白逐漸減少的基礎上,首次檢測到在神經(jīng)元分化過程中,p300可被μ型鈣蛋白酶特異性剪切而產(chǎn)生大量的約100kD大小的氨基末端片段,并初步證明該片段具有比全長p300更強的促神經(jīng)細胞分化作用。1.小鼠胚腦和N2a細胞分化發(fā)育過程中p300水平逐漸下降 為了明確在神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育過程中存在p300轉(zhuǎn)錄水平升高的同時蛋白水平下降這一現(xiàn)象,首先,我們提取E9.5至E16.5小鼠胚胎全腦的蛋白,檢測小鼠胚胎腦分化發(fā)育過程中p300蛋白水平的變化趨勢。結果顯示,在小鼠胚胎E9.5至E15.5期間,p300的蛋白水平則逐漸下降。繼而,我們對N2a細胞用RA誘導分化0-48h后,應用RT-PCR和Western blot技術檢測到p300 mRNA和蛋白水平,發(fā)現(xiàn)隨著誘導時間的延長,p300 mRNA逐漸升高而蛋白質(zhì)水平下降。以上結果說明,在神經(jīng)組織或神經(jīng)細胞分化發(fā)育過程中,同樣存在p300轉(zhuǎn)錄水平升高同時蛋白表達水平下降現(xiàn)象。2.小鼠胚腦和N2a細胞分化發(fā)育過程中全長p300蛋白水平下降而p300100kD裂解片段升高在小鼠胚腦和N2a細胞分化發(fā)育過程中,p300表達水平逐漸下降的現(xiàn)象體提示,p300在神經(jīng)分化中可能被大量降解。為此,應用識別p300氨基末端的抗體對不同胚齡小鼠腦組織和經(jīng)RA誘導不同時間的N2a細胞中全長p300 (full length p300, FL-p300)及其降解產(chǎn)物的水平變化情況進行Western blot檢測。結果顯示,在約100kD大小處可見一明顯降解片段——p300100kD片段(100kD fragment of p300, 100kD p300)。該降解片段水平在E9.5至E12.5腦中以及RA誘導分化的0至2d的N2a細胞中隨著FL-p300水平的逐漸降低而上升;在E13.5至E16.5期間,則與FL-p300同步下降。3.產(chǎn)生100kD p300的裂解位置在p300氨基酸726-1020區(qū)域100kD p300能被識別p300氨基末端的抗體識別,根據(jù)分子量計算其產(chǎn)生位置應在p300氨基末端1/3處。由于p300的同源蛋白CBP在細胞分化過程中沒有類似于p300基因轉(zhuǎn)錄增加而蛋白水平降低的現(xiàn)象,且盡管CBP和p300的序列一致性高達60%,但在氨基末端1/3處二者序列相似度很低,因此我們以同源蛋白CBP做對照來確定100kD p300的裂解位置。根據(jù)CBP和p300的氨基末端1/3處可能裂解位置處的氨基酸序列,構建表達FL-p300裂解位點競爭性底物的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染N2a后用RA誘導36h。Western blot檢測顯示,轉(zhuǎn)染表達CBP (aa 777-974)短片段(CBP short fragment, CBP S)和CBP (aa 726-1020)長片段(CBP long fragment, CBP L)的細胞,100kD p300的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)染表達HA的細胞無明顯區(qū)別,而轉(zhuǎn)染表達p300(aa777-974)短片段(p300 short fragment, p300 S)和p300(aa 726-1020)長片段(p300long fragment, p300 L)的細胞,100kD p300的產(chǎn)生較轉(zhuǎn)染表達HA的細胞減少,即p300 S和p300 L能抑制RA誘導分化過程中100kD p300的產(chǎn)生,且以p300 L的抑制作用更明顯。對RA誘導N2a細胞突起生長(神經(jīng)細胞分化的標志之一)作用的比較顯示,p300 S和p300 L對RA誘導的N2a突起生長也具有抑制作用,并以p300 L的抑制作用更顯著。由此表明,產(chǎn)生100 kD p300的裂解位置在p300氨基酸726-1020區(qū)域,并提示p300在此區(qū)域的裂解可促進神經(jīng)細胞的分化。4.μ型鈣蛋白酶是產(chǎn)生100kD p300的剪切酶為了尋找產(chǎn)生100kD p300的剪切酶,首先觀察了蛋白酶體抑制劑MG132和鈣蛋白酶抑制劑calpeptin對分化誘導N2a細胞產(chǎn)生100kD p300的影響。在5%FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的未分化N2a細胞中,MG132和calpeptin對p300的降解和100 kD p300的產(chǎn)生沒有影響,而在含RA培養(yǎng)基培養(yǎng)的N2a細胞中,MG132雖可阻斷p300的降解,卻不影響100kD p300的產(chǎn)生；而calpeptin抑制FL-p300降解的同時也抑制了100kD p300的產(chǎn)生。由此說明calpain是100kD p300產(chǎn)生的剪切酶。根據(jù)激活時所需Ca2+濃度數(shù)量級不同,鈣蛋白酶家族分為μ型鈣蛋白酶(微摩爾級)和m型鈣蛋白酶(毫摩爾級)兩類。為了明確μ型鈣蛋白酶和m型鈣蛋白酶對p300的剪切及100kD p300的產(chǎn)生是否具有不同的影響,使用5 μmol/L和5mmol/L兩種數(shù)量級濃度的Ca2+分別激活體外的μ型鈣蛋白酶和m型鈣蛋白酶來比較兩種鈣蛋白酶對小鼠E13.5胚胎全腦蛋白中p300裂解的差異。免疫印跡技術檢測顯示,隨著濃度的升高,m型鈣蛋白酶雖然可促進FL-p300裂解,但對100kDp300的產(chǎn)生沒有影響,而μ型鈣蛋白酶既可促進FL-p300的裂解也可促進100kDp300的形成,其最適濃度范圍為0.01 U/μl～0.02 U/μl。當在加入0.003 U/μl或0.01U/μl的μ型鈣蛋白酶同時加入10 μmol/L calpeptin,對FL-p300的剪切被明顯抑制,尤其是對0.01 U/μl μ型鈣蛋白酶抑制效果更為明顯。因此,μ型鈣蛋白酶是產(chǎn)生100kD p300的剪切酶。在N2a細胞轉(zhuǎn)染表達氨基末端鏈接標簽HA的p300后提取蛋白,用p型鈣蛋白酶進行酶切,用HA標簽抗體進行Western blot檢測發(fā)現(xiàn),μ型鈣蛋白酶剪切p300產(chǎn)生的100kD p300片段帶有HA標記,加入calpeptin可抑制帶HA的100kD片段產(chǎn)生。因此,μ型鈣蛋白酶對p300進行剪切的位點位于p300氨基末端1/3處。進一步應用Western blot對發(fā)育過程中小鼠胚胎腦蛋白中μ型鈣蛋白酶水平的變化進行檢測顯示,從E9.5至E15.5,腦內(nèi)μ型鈣蛋白酶激活型大亞基水平逐漸升高,表明胚胎發(fā)育過程中100kD p300產(chǎn)生的逐漸增加與μ型鈣蛋白酶活性逐漸增強有關。5.100kD p300促進N2a細胞的分化發(fā)育為了了解分化發(fā)育中FL-p300被剪切產(chǎn)生100kD片段的可能功能意義,繼而分析了過表達不同p300片段對N2a細胞分化發(fā)育的影響。結果顯示,過表達p300氨基末端片段(aa9-1007,p300 N)能顯著促進N2a細胞突起的生長和GAP43蛋白水平上升：過表達p300羧基末端片段(aa1006-2414,p300 C)可促進N2a細胞中p53乙�；�,但對N2a細胞突起生長和GAP43蛋白水平上升無明顯影響。而共同過表達p300 N和p300 C,其促進突起生長和GAP43蛋白水平上升的作用較弱,與過表達全長p300類似或略弱于全長p300,明顯弱于p300 N;促進p53乙酰化的作用強于全長p300,但明顯低于p300 C。由此表明,p300促進神經(jīng)分化的功能主要由p300氨基末端100kD片段完成,p300羧基末端片段具有較強的促乙酰化功能,全長p300促分化與乙�；δ芫^弱。結論：在神經(jīng)分化發(fā)育過程中,乙酰轉(zhuǎn)移酶p300被μ型鈣蛋白酶在p300氨基末端1/3處剪切產(chǎn)生約100kD片段,剪切位點位于氨基酸726-1020區(qū)域；p300促進神經(jīng)細胞分的作用主要依靠由μ型鈣蛋白酶特異性剪切產(chǎn)生氨基末端100kD片段來完成,發(fā)揮乙酰化作用主要通過其羧基末端片段實現(xiàn),全長p300促進神經(jīng)細胞分化和乙�；饔镁^弱。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R338

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本文編號：1574934