本文選題：異種移植　切入點：ZFN　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：(1)GGTA1敲除豬的研究面臨器官移植供體短缺的現(xiàn)狀,異種移植是一種可行的替代方案。大量研究證明豬是合適的異種移植供體。使用豬進行異種移植仍然需要克服許多免疫排斥障礙,包括超急性免疫排斥反應(yīng)(HAR),急性體液異種排斥反應(yīng)(AHXR),急性細胞排斥反應(yīng)(ACR),凝血功能異常,慢性排斥反應(yīng)(CR)和炎癥反應(yīng)等�；谙嚓P(guān)致病機理的研究,研究人員認為制備基因修飾豬是克服異種移植免疫排斥障礙的有效措施。目前功能正常的豬多能干細胞系仍然沒有建立,而基于同源重組進行的基因修飾在豬體細胞中效率較低,嚴重制約了相關(guān)研究的進展。最近幾年出現(xiàn)了多種高效的基因定點修飾工具,包括鋅指核酶(ZFN),轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)以及CRISPR/Cas9。這些技術(shù)被成功地應(yīng)用于各種模式生物中,我們也建立了基于ZFN和TALEN的豬基因修飾系統(tǒng)。我們首先使用ZFN制備GGTA1KO(GTKO)豬,然后在GTKO豬細胞中使用TALEN對豬白細胞抗原(SLAs)相關(guān)基因進行修飾。GGTA1參與形成的Ga1是引起HAR的主要異種抗原。在進化過程中,GGTA1在人類和舊世界猴中失去功能,導致他們的細胞表面沒有Ga1抗原,所以他們血液中存在大量靶向Ga1抗原的天然抗體。為了克服HAR障礙,研究人員在豬體細胞上通過同源重組修飾GGTA1并結(jié)合體細胞核移植技術(shù)制備GTKO豬,通過異種移植實驗表明GTKO豬可以顯著抑制HAR的發(fā)生。但是這種技術(shù)不僅效率很低,而且會引入外源的抗藥基因,無法滿足后續(xù)大量基因修飾的需求。我們將靶向GGTA1編碼區(qū)序列的ZFN質(zhì)粒和抗藥質(zhì)粒通過瞬轉(zhuǎn)手段導入胎豬成纖維細胞中,經(jīng)過藥物篩選獲得了18個單拷貝敲除和4個雙拷貝敲除的細胞克隆,效率分別為23.4%和5.2%。隨后我們將獲得的雙拷貝敲除的細胞作為核供體進行體細胞核移植,產(chǎn)生克隆豬。經(jīng)鑒定,一共獲得3頭GTKO豬。同時我們利用克隆胎兒建立了一個GTKO胎豬成纖維細胞系。通過細胞表面標記鑒定證明GTKO豬的細胞膜上Ga1抗原被完全清除。通過殺傷實驗證明GTKO豬的細胞可以在與人血清共培養(yǎng)時不受抗體補體介導的免疫攻擊。在GTKO豬的基礎(chǔ)上,我們通過TALEN技術(shù)修飾豬的SLAs,將其中的部分基因替換為人類白細胞抗原(HLAs)中的部分基因。我們設(shè)計并驗證了靶向SLA-1和-2的TALEN。同時我們設(shè)計并構(gòu)建了相關(guān)的KI載體進行基因替換實驗。通過PCR驗證HLA-A基因成功替代SLA-1,并能在豬細胞中表達。這一策略在異種移植中的效果仍需要使用實驗豬進行進一步的異種移植驗證。(2)低免疫原性人多能干細胞的研究人多能干細胞(hPSCs)具有自我更新能力,并可以在一定條件下分化為機體內(nèi)所有的細胞類型。所以研究人員嘗試將hPSCs分化為各種組織細胞,用于移植替換病人身上受損的組織細胞。在人類同種異體組織器官移植的過程中,供受體細胞表面的HLAs不兼容會導致免疫排斥反應(yīng)。HLAs分為HLA Ⅰ和HLA Ⅱ:CD8+T細胞識別HLA Ⅰ,參與直接靶細胞殺傷作用;CD4+T細胞識別HLA Ⅱ,分泌大量細胞因子參與調(diào)控免疫反應(yīng)。我們實驗室的工作重點在于使用定點基因修飾的方法降低hPSCs的免疫原性,以滿足其臨床使用的要求。我們實驗室之前通過對B2M的KO已經(jīng)建立了 HLA Ⅰ缺陷的hPSCs,證明了其免疫原性的降低,同時hPSCs的多能性和自我更新能力都沒有顯著的變化。在本研究中我們使用TALEN對HLA Ⅱ的關(guān)鍵調(diào)控基因CIITA進行KO,從而降低hPSCs及其分化獲得的細胞中的HLA Ⅱ相關(guān)基因的表達。CIITA-/-hPSCs在自我更新和分化能力方面與WT hPSCs無明顯差異。將CIITA-/-hPSCs分化為樹突狀細胞(DCs)后,CD83和CD86等表面蛋白標記物正常表達,但其結(jié)構(gòu)型HLA Ⅱ表達顯著下降。將CIITA-/-hPSCs分化為成纖維細胞后,在IFN-γ的刺激下誘導型HLA Ⅱ表達顯著下降。將分化獲得的CIITA--成纖維細胞與CD4+T細胞共培養(yǎng),CD4+T的活化減弱。這些結(jié)果說明CIITA-/-hPSCs分化獲得的組織細胞可能降低CD4+T細胞介導的免疫排斥反應(yīng)。我們的研究將有利于推動hPSCs的臨床應(yīng)用,尤其是將hPSCs分化為結(jié)構(gòu)型高表達HLAII的組織細胞進行移植替換,比如DCs和T細胞等。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392.4
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本文編號：1571906