本文選題：天然免疫反應(yīng)　切入點(diǎn)：泛素化　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：TRIM 14 (tripartite motif-containing 14)是TRIM家族的蛋白,含有B-box 、 coiled-coil和PRYSPRY結(jié)構(gòu)域。前期通過siRNA文庫篩選發(fā)現(xiàn)TRIM 14在病毒引起的宿主天然免疫反應(yīng)中具有調(diào)控功能。進(jìn)一步研究表明TRIM 14定位于線粒體外膜,通過C-末端PRYSPRY結(jié)構(gòu)域與RLRs (RIG-I like receptors)信號通路中的線粒體接頭分子MAVS (mitochondria antiviral signaling)相互作用,并與天然免疫調(diào)節(jié)因子NEMO (NF-κB essential modulator)蛋白直接相互作用。但是,TRIM 14通過與NEMO及MAVS的相互作用調(diào)控天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制仍不明確。另外,由于天然免疫分子的活化必須受到嚴(yán)格調(diào)控以防止過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體損傷,我們推測TRIM 14的活性也受到調(diào)控。鑒于此,我們深入分析了TRIM14對線粒體天然免疫的調(diào)控機(jī)制,并對TRIM 14自身活性的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究將為闡明抗病毒天然免疫反應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。本研究首先對TRIM 14與NEMO相互作用的具體機(jī)制及功能進(jìn)行深入分析,以闡明TRIM 14調(diào)控線粒體天然免疫的分子機(jī)制。通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)泛素鏈感受蛋白NEMO的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域NUB (NEMO ubiquitin-binding)和ZF (zinc finger)結(jié)構(gòu)域是與TRIM 14的結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,刪除NUB和ZF結(jié)構(gòu)域嚴(yán)重影響NEMO與TRIM 14的結(jié)合以及I型干擾素的表達(dá)。同時(shí),SeV感染細(xì)胞后,TRIM 14發(fā)生K63泛素化。突變分析表明,TRIM14 K365位點(diǎn)是K63泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn),該位點(diǎn)突變后,TRIM 14與NEMO的結(jié)合能力及誘導(dǎo)干擾素啟動(dòng)子活性的能力都下降。上述結(jié)果表明TRIM 14通過結(jié)合的泛素化鏈與NEMO相互作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),SeV感染后MAVS與NEMO相互結(jié)合,并在感染6小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰,過表達(dá)TRIM 14促進(jìn)NEMO與MAVS之間的相互作用,而在THP1細(xì)胞中敲低TRIM 14后,病毒誘導(dǎo)的NMEO與MAVS的結(jié)合減弱,同時(shí)NEMO轉(zhuǎn)移至線粒體的過程受到抑制。以上結(jié)果提示TRIM 14在病毒感染后發(fā)生泛素化并通過泛素鏈招募NEMO到線粒體上促進(jìn)MAVS信號小體的組裝,該研究結(jié)果闡釋了TRIM 14介導(dǎo)線粒體抗病毒天然免疫反應(yīng)的機(jī)制。為深入研究TRIM 14自身活性調(diào)控機(jī)制,結(jié)合TRIM 14在病毒感染過程中受到泛素化調(diào)控這一現(xiàn)象,我們對RLRs信號通路相關(guān)的E3泛素連接酶進(jìn)行篩選,結(jié)果表明E3泛素連接酶RNF125過表達(dá)增強(qiáng)TRIM 14泛素化水平。免疫熒光共聚焦顯示過表達(dá)的RNF125和TRIM14,共定位于線粒體。免疫共沉淀結(jié)果證明RNF125通過RING結(jié)構(gòu)域與TRIM 14相互作用。進(jìn)一步研究表明,RNF125通過蛋白酶體途徑降解TRIM14.基于上述現(xiàn)象,我們推測RNF125有可能是TRIM 14的E3泛素連接酶。突變實(shí)驗(yàn)證明,刪除RNF125的RING結(jié)構(gòu)域或者突變其泛素連接酶活性位點(diǎn)C72/75導(dǎo)致RNF125喪失促進(jìn)TRIM 14的泛素化。同時(shí),體外酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)RNF125是TRIM 14的E3泛素連接酶。敲除RNF125的小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)細(xì)胞在干擾素處理后,TRIM 14的表達(dá)量持續(xù)增加,而野生型MEF細(xì)胞中TRIM 14表達(dá)量在后期下降。另外,RNF125過表達(dá)抑制TRIM 14激活I(lǐng)型干擾素和NF-κB啟動(dòng)子的功能,反之,敲低RNF125,則促進(jìn)TRIM 14的功能。以上實(shí)驗(yàn)表明RNF125對TRIM 14具有負(fù)調(diào)控功能。綜上所述,TRIM 14通過K365泛素鏈招募NEMO至線粒體促進(jìn)MAVS信號復(fù)合物的組裝,正向調(diào)控抗病毒天然免疫反應(yīng)。另一方面,RNF125通過促進(jìn)TRIM 14泛素化導(dǎo)致其通過蛋白酶體降解,對TRIM 14進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)了TRIM 14調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫反應(yīng)的機(jī)制以及TRIM 14自身活性調(diào)控機(jī)制,為深入地理解宿主抗病毒天然免疫信號及其調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1559834