本文選題：5-乙炔基-2’脫氧尿苷　切入點：細胞增殖　出處：《首都醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:5-乙炔基-2’脫氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)是一種新型有效的細胞增殖檢測方法,而流式細胞術(shù)能夠進行多重染色,可同時分析多種淋巴細胞亞群,在進行淋巴細胞檢測時更有優(yōu)勢。本研究旨在建立EdU摻入法用于T淋巴細胞體內(nèi)增殖的方法,優(yōu)化流式細胞術(shù)檢測EdU染色過程,并評估EdU檢測體內(nèi)淋巴細胞增殖的有效性。方法:首先將C57BL/6小鼠來源脾細胞進行體外染色、固定、透膜及EdU染色,明確EdU染色過程中4%多聚甲醛固定劑,皂素和Triton X-100透膜劑,以及Click反應過程對常見淋巴細胞CD3、CD4、CD8、CD19、CD25抗原完整性及不同熒光標記抗體熒光強度的影響,優(yōu)化EdU染色過程,并對比皂素和Triton X-100透膜劑對EdU陽性率的影響;然后通過向B6D2F1小鼠尾靜脈注射CD45.1陽性C57BL/6小鼠來源脾細胞建立過繼性轉(zhuǎn)移淋巴細胞體內(nèi)增殖模型,比較不同方式(尾靜脈、腹腔注射)、不同劑量(0-30 mg/kg)EdU之間淋巴細胞增殖率差異,從而優(yōu)化檢測體內(nèi)淋巴細胞增殖時EdU使用方法。此外也對優(yōu)化的EdU摻入法與5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)及羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)用于體內(nèi)淋巴細胞增殖檢測時的效能進行了比較研究。最后通過優(yōu)化的EdU摻入方法檢測體內(nèi)固有胸腺細胞及骨髓細胞的增殖。結(jié)果:脾細胞表面染色后經(jīng)適當固定、透膜可以保護CD3+T細胞、CD4+T細胞及CD8+T細胞表面抗原的完整性,并對APC、PE、PE-Cy7、FITC和Per CP-Cy5.5熒光強度無明顯影響;Click反應可使PE、PE-Cy7熒光強度明顯下降,PE、PECy7偶聯(lián)抗體可在Click反應后進行表面染色,染色前使用3%FBS室溫孵育封閉30 min可有效降低淋巴細胞的假陽性率;尾靜脈與腹腔注射EdU,檢測到淋巴細胞增殖率無明顯差別(P0.05);淋巴細胞增殖率呈EdU劑量依賴式增加,當劑量增加至20 mg/kg時,增殖率達到飽和;EdU摻入法檢測淋巴細胞增殖率與BrdU法無明顯差異,但均低于CFSE。在檢測體內(nèi)固有淋巴細胞增殖時,胸腺細胞及骨髓細胞中具有明顯的EdU陽性細胞。結(jié)論:1.EdU摻入法聯(lián)合流式細胞術(shù)可用于檢測體內(nèi)T淋巴細胞增殖。2.優(yōu)化的EdU摻入法與BrdU法檢測T細胞增殖效能一致,但更簡單易行。3.EdU摻入法可用于體內(nèi)固有淋巴細胞的檢測。目的:雙陰性T細胞(double negative T cells,DNT細胞)是體內(nèi)一類能夠負性調(diào)節(jié)機體免疫反應的淋巴細胞,但其來源尚不清楚。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNT細胞可以從CD4+T細胞轉(zhuǎn)化而來,而CD4+T細胞只有在經(jīng)過分裂增殖之后才可以向DNT細胞轉(zhuǎn)化。共刺激分子在CD4+T細胞的活化增殖中發(fā)揮了重要作用,本研究在前期研究基礎(chǔ)上進一步探討共刺激分子在DNT細胞轉(zhuǎn)化及增殖中的作用及相關(guān)機制。方法:首先通過共刺激分子中和抗體及基因敲除(gene knockout,KO)小鼠探討OX40、CD40及CD28共刺激信號對DNT細胞轉(zhuǎn)化效率的影響,并檢測轉(zhuǎn)化的DNT細胞表面OX40的表達量。同時用體外培養(yǎng)及體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移的方法,通過EdU、Annexin V及流式檢測,對比B6 DNT與OX40 KO DNT細胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bcl-x L、Survivin及BCL2樣蛋白11(BCL2 like protein 11,BCL2L11)表達差異,明確OX40在DNT增殖調(diào)控中的作用。其次使用外源性IL-2體外刺激B6 DNT細胞,明確IL-2與OX40關(guān)系。體內(nèi)外分別用IL-2 Fc蛋白/IL-2刺激B6 DNT及OX40 KO DNT細胞,通過EdU及Annexin V方法檢測DNT細胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白變化,明確OX40是否參與IL-2對DNT細胞存活的調(diào)控。最后通過生物學預測方法確定OX40啟動子上游轉(zhuǎn)錄因子,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子激動劑,明確參與IL-2調(diào)控OX40分子表達的信號分子。結(jié)果:在DNT細胞轉(zhuǎn)化體系中加入OX40中和抗體后,DNT細胞的轉(zhuǎn)化效率明顯降低,而加入CD40、CD80及CD86中和抗體后DNT細胞的轉(zhuǎn)化效率無明顯下降。同時利用OX40 KO小鼠來源的CD4+T淋巴細胞進行體外轉(zhuǎn)化進一步證實了OX40可參與調(diào)控DNT細胞的轉(zhuǎn)化。流式檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的DNT細胞表達OX40,且其表達量顯著高于活化的CD4+T細胞,而凋亡率較其減少。通過體內(nèi)外對比研究發(fā)現(xiàn),OX40敲除后DNT細胞EdU陽性率下降,Annexin V比例增加,提示OX40 KO DNT細胞增殖減少,凋亡增加;同時流式及real-time PCR結(jié)果均顯示OX40 KO DNT細胞Bcl-2、Bcl-x L、Survivin等抗凋亡基因表達低于B6 DNT,BCL2L11促凋亡基因表達高于B6 DNT,OX40敲除后NFκB1、P65信號通路活性降低。IL-2刺激使DNT細胞OX40表達增加,體內(nèi)外實驗對比分析B6 DNT、B6 DNT+IL-2及OX40 KO DNT+IL-2三組間DNT的活性發(fā)現(xiàn),加入IL-2后DNT增殖增加、凋亡減少,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-x L、Survivin表達上調(diào),而當IL-2刺激OX40 KO DNT細胞時,其增殖減少、凋亡增加,且上述抗凋亡基因表達出現(xiàn)一定程度的下降。IL-2刺激可導致DNT細胞內(nèi)PPARγ下調(diào),同時PPARγ激動劑可使DNT細胞表面OX40表達降低,增殖減少,凋亡增加,Bcl-2、Bcl-x L抗凋亡基因表達下降,BCL2L11促凋亡基因表達上升。結(jié)論:1.OX40共刺激信號可增加DNT細胞的轉(zhuǎn)化效率。2.OX40共刺激分子通過NF-κB信號通路上調(diào)Bcl-2、Bcl-x L、Survivin抗凋亡基因,并下調(diào)BCL2L11促凋亡基因表達,促進DNT增殖、減少凋亡。3.IL-2可以通過直接調(diào)控OX40表達,發(fā)揮促進DNT細胞增殖,減少凋亡的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱平;;移植后淋巴細胞增殖病的病因和臨床診治[J];中華醫(yī)學雜志;2006年42期

2 高文濤,張一楚,姜洪華,歐敬民,于勇;局部腎素血管緊張素系統(tǒng)在人T淋巴細胞增殖中的表達及作用[J];上海醫(yī)學;2003年06期

3 沈(王羽)t2,吳寧華,程小款,張力,衡鳳燕;升溫對T淋巴細胞增殖的影響[J];中國醫(yī)學科學院學報;1988年04期

4 石玉城,曹素元,楊在綱;固本消敏湯對淋巴細胞增殖的影響及方劑作用分析[J];貴陽中醫(yī)學院學報;1991年04期

5 王華;;淋巴細胞增殖試驗作為毒物暴露生物指標的可能性[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);1992年04期

6 張志慧;陳金亮;王殿華;;龜鹿益髓膠囊對實驗性腦脊髓炎發(fā)病情況、T淋巴細胞增殖及細胞因子的影響[J];時珍國醫(yī)國藥;2008年06期

7 仲人前;體外測定B淋巴細胞增殖法[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;1989年01期

8 聶小華,史寶軍,敖宗華,尹光耀,金堅,陶文沂;黃芪活性成分的提取及其對淋巴細胞增殖的影響[J];無錫輕工大學學報;2003年04期

9 宋朋紅,謝海洋,鄭樹森,吳健;蛋白酶體抑制劑對T淋巴細胞增殖活化的影響[J];中國病理生理雜志;2005年03期

10 呂佩源;宋春風;高昌星;井上敦;;實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎T淋巴細胞增殖和腫瘤壞死因子-α變化的意義(英文)[J];疑難病雜志;2006年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉擁軍;;銀消顆粒對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響[A];中華中醫(yī)藥學會皮膚科分會第七次學術(shù)年會、2010年重慶四川中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學術(shù)年會、全國中西醫(yī)結(jié)合診療皮膚性病新進展新技術(shù)學習班論文匯編[C];2010年

2 宋朋紅;謝海洋;鄭樹森;吳健;;蛋白酶體抑制劑對T淋巴細胞增殖活化的影響[A];2004年浙江省外科學學術(shù)年會論文匯編[C];2004年

3 賈永前;曾婷婷;潘曉夫;李亞瓊;范家鳳;孟文彤;;骨髓間充質(zhì)干細胞及轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細胞對淋巴細胞增殖的影響[A];中華醫(yī)學會第八次全國血液學學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

4 白彥萍;陳志華;李紅艷;楊頂權(quán);;常用中藥靜脈注射劑對T淋巴細胞增殖的影響的比較[A];2003中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學術(shù)會議論文匯編[C];2003年

5 吳嵐;趙麗娟;楊娉婷;魯靜;肖衛(wèi)國;;紅霉素對T淋巴細胞增殖的影響[A];第十屆全國風濕病學學術(shù)會議論文集[C];2005年

6 朱平;;移植后淋巴細胞增殖病的病因和臨床診治[A];第一屆全國難治性淋巴瘤學術(shù)研討會暨第二屆全國多發(fā)性骨髓瘤學術(shù)研討會（國家級血液系統(tǒng)惡性腫瘤繼續(xù)醫(yī)學教育學習班）繼續(xù)教育集[C];2007年

7 曹秀明;馬嬌;萬曉峰;;N-乙酰氨基葡萄糖激活Ca~(2+)信號通路體外誘導小鼠T淋巴細胞增殖[A];全國第十一屆生化與分子藥理學學術(shù)會議論文集[C];2009年

8 丁晨光;田普訓;薛武軍;潘曉鳴;項和立;李楊;靳占奎;毛天賜;段萬里;席敏;田曉輝;;蟲草素在體外抑制T淋巴細胞增殖和向Th17分化[A];2012中國器官移植大會論文匯編[C];2012年

9 宋向鳳;孫翔;王輝;;雌孕激素對淋巴細胞增殖的影響[A];第6次全國微生物學與免疫學大會論文摘要匯編[C];2004年

10 陳櫻;鄧為民;姚智;李海東;;高糖促進美羅華對人B淋巴細胞增殖的抑制作用及相關(guān)機制[A];中華醫(yī)學會第九次全國檢驗醫(yī)學學術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 陳丹;血細胞轉(zhuǎn)化為iPS細胞可無需病毒載體[N];科技日報;2012年

2 本報記者 章迪思邋徐瑞哲;“全能細胞”：路還很長[N];解放日報;2007年

3 記者 胡其峰;干細胞臨床研究應嚴格資質(zhì)審核[N];光明日報;2013年

4 記者 黃X;科學家將iPS細胞轉(zhuǎn)化率提高約百倍[N];新華每日電訊;2009年

5 王芳　編譯;T細胞：專攻擊癌癥和艾滋病毒[N];北京科技報;2013年

6 中國科學院微生物研究所研究員 羅明典;應關(guān)注三大問題[N];光明日報;2001年

7 黃X;新發(fā)現(xiàn)可將iPS細胞轉(zhuǎn)化率提高約百倍[N];大眾科技報;2009年

8 ;人體衛(wèi)士：T細胞和B細胞[N];人民政協(xié)報;2003年

9 王艷紅;牛皮細胞“返老還童”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

10 首席記者 任荃;皮膚細胞“育”出三代活小鼠[N];文匯報;2009年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 趙洪強;哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2在白介素-35介導T淋巴細胞增殖抑制中的作用及機制[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2015年

2 王瑾;抗β1-腎上腺素受體自身抗體對T淋巴細胞增殖和分泌功能的影響[D];山西醫(yī)科大學;2011年

3 蔣燕靈;抗B7分子單克隆抗體與免疫抑制劑聯(lián)用對感染人巨細胞病毒的T淋巴細胞增殖影響及機理初探[D];浙江大學;2007年

4 侯穎;重組大腸桿菌全細胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成苯丙酮酸的研究[D];江南大學;2017年

5 凌立勉;結(jié)直腸癌患者體內(nèi)粘膜相關(guān)恒定T細胞的表達及功能研究[D];吉林大學;2016年

6 楊一;敲除Grail基因能提升CD8~+ T細胞的抗腫瘤活性[D];吉林大學;2017年

7 雒真龍;Galectin-7通過TGFβ/Smad3途徑促進T淋巴細胞增殖和向Th1細胞偏移[D];華中科技大學;2013年

8 譚亞敏;異基因造血干細胞移植后急性移植物抗宿主病防治策略及其關(guān)鍵T細胞和細胞因子研究[D];浙江大學;2014年

9 蔡治濤;Foxo1參與調(diào)控自然調(diào)節(jié)性T細胞（nTreg）增殖與凋亡的機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

10 劉媛;CXCR3在原發(fā)性膽汁性肝硬化中對CD8~+T細胞作用的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 胡帥;IgA腎病患者外周B淋巴細胞miR-374b致病機制研究[D];南京大學;2016年

2 宋瑾;人羊膜間充質(zhì)干細胞對淋巴細胞增殖的影響及致瘤性研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 呂婷婷;β_1-腎上腺素受體自身抗體對大鼠B淋巴細胞增殖的影響及其可能機制[D];山西醫(yī)科大學;2012年

4 禚守蓉;XGD-1對人外周血T淋巴細胞增殖和IL-2R表達的影響[D];昆明醫(yī)學院;2003年

5 郭o勖，

本文編號：1559609