本文選題：5-乙炔基-2’脫氧尿苷　切入點(diǎn)：細(xì)胞增殖　出處：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:5-乙炔基-2’脫氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)是一種新型有效的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法,而流式細(xì)胞術(shù)能夠進(jìn)行多重染色,可同時(shí)分析多種淋巴細(xì)胞亞群,在進(jìn)行淋巴細(xì)胞檢測(cè)時(shí)更有優(yōu)勢(shì)。本研究旨在建立EdU摻入法用于T淋巴細(xì)胞體內(nèi)增殖的方法,優(yōu)化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EdU染色過(guò)程,并評(píng)估EdU檢測(cè)體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖的有效性。方法:首先將C57BL/6小鼠來(lái)源脾細(xì)胞進(jìn)行體外染色、固定、透膜及EdU染色,明確EdU染色過(guò)程中4%多聚甲醛固定劑,皂素和Triton X-100透膜劑,以及Click反應(yīng)過(guò)程對(duì)常見(jiàn)淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8、CD19、CD25抗原完整性及不同熒光標(biāo)記抗體熒光強(qiáng)度的影響,優(yōu)化EdU染色過(guò)程,并對(duì)比皂素和Triton X-100透膜劑對(duì)EdU陽(yáng)性率的影響;然后通過(guò)向B6D2F1小鼠尾靜脈注射CD45.1陽(yáng)性C57BL/6小鼠來(lái)源脾細(xì)胞建立過(guò)繼性轉(zhuǎn)移淋巴細(xì)胞體內(nèi)增殖模型,比較不同方式(尾靜脈、腹腔注射)、不同劑量(0-30 mg/kg)EdU之間淋巴細(xì)胞增殖率差異,從而優(yōu)化檢測(cè)體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖時(shí)EdU使用方法。此外也對(duì)優(yōu)化的EdU摻入法與5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)及羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)用于體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)時(shí)的效能進(jìn)行了比較研究。最后通過(guò)優(yōu)化的EdU摻入方法檢測(cè)體內(nèi)固有胸腺細(xì)胞及骨髓細(xì)胞的增殖。結(jié)果:脾細(xì)胞表面染色后經(jīng)適當(dāng)固定、透膜可以保護(hù)CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞表面抗原的完整性,并對(duì)APC、PE、PE-Cy7、FITC和Per CP-Cy5.5熒光強(qiáng)度無(wú)明顯影響;Click反應(yīng)可使PE、PE-Cy7熒光強(qiáng)度明顯下降,PE、PECy7偶聯(lián)抗體可在Click反應(yīng)后進(jìn)行表面染色,染色前使用3%FBS室溫孵育封閉30 min可有效降低淋巴細(xì)胞的假陽(yáng)性率;尾靜脈與腹腔注射EdU,檢測(cè)到淋巴細(xì)胞增殖率無(wú)明顯差別(P0.05);淋巴細(xì)胞增殖率呈EdU劑量依賴式增加,當(dāng)劑量增加至20 mg/kg時(shí),增殖率達(dá)到飽和;EdU摻入法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖率與BrdU法無(wú)明顯差異,但均低于CFSE。在檢測(cè)體內(nèi)固有淋巴細(xì)胞增殖時(shí),胸腺細(xì)胞及骨髓細(xì)胞中具有明顯的EdU陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)論:1.EdU摻入法聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)可用于檢測(cè)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖。2.優(yōu)化的EdU摻入法與BrdU法檢測(cè)T細(xì)胞增殖效能一致,但更簡(jiǎn)單易行。3.EdU摻入法可用于體內(nèi)固有淋巴細(xì)胞的檢測(cè)。目的:雙陰性T細(xì)胞(double negative T cells,DNT細(xì)胞)是體內(nèi)一類(lèi)能夠負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞,但其來(lái)源尚不清楚。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞可以從CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái),而CD4+T細(xì)胞只有在經(jīng)過(guò)分裂增殖之后才可以向DNT細(xì)胞轉(zhuǎn)化。共刺激分子在CD4+T細(xì)胞的活化增殖中發(fā)揮了重要作用,本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討共刺激分子在DNT細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增殖中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法:首先通過(guò)共刺激分子中和抗體及基因敲除(gene knockout,KO)小鼠探討OX40、CD40及CD28共刺激信號(hào)對(duì)DNT細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響,并檢測(cè)轉(zhuǎn)化的DNT細(xì)胞表面OX40的表達(dá)量。同時(shí)用體外培養(yǎng)及體內(nèi)過(guò)繼轉(zhuǎn)移的方法,通過(guò)EdU、Annexin V及流式檢測(cè),對(duì)比B6 DNT與OX40 KO DNT細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bcl-x L、Survivin及BCL2樣蛋白11(BCL2 like protein 11,BCL2L11)表達(dá)差異,明確OX40在DNT增殖調(diào)控中的作用。其次使用外源性IL-2體外刺激B6 DNT細(xì)胞,明確IL-2與OX40關(guān)系。體內(nèi)外分別用IL-2 Fc蛋白/IL-2刺激B6 DNT及OX40 KO DNT細(xì)胞,通過(guò)EdU及Annexin V方法檢測(cè)DNT細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白變化,明確OX40是否參與IL-2對(duì)DNT細(xì)胞存活的調(diào)控。最后通過(guò)生物學(xué)預(yù)測(cè)方法確定OX40啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄因子,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子激動(dòng)劑,明確參與IL-2調(diào)控OX40分子表達(dá)的信號(hào)分子。結(jié)果:在DNT細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中加入OX40中和抗體后,DNT細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率明顯降低,而加入CD40、CD80及CD86中和抗體后DNT細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率無(wú)明顯下降。同時(shí)利用OX40 KO小鼠來(lái)源的CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化進(jìn)一步證實(shí)了OX40可參與調(diào)控DNT細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的DNT細(xì)胞表達(dá)OX40,且其表達(dá)量顯著高于活化的CD4+T細(xì)胞,而凋亡率較其減少。通過(guò)體內(nèi)外對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),OX40敲除后DNT細(xì)胞EdU陽(yáng)性率下降,Annexin V比例增加,提示OX40 KO DNT細(xì)胞增殖減少,凋亡增加;同時(shí)流式及real-time PCR結(jié)果均顯示OX40 KO DNT細(xì)胞Bcl-2、Bcl-x L、Survivin等抗凋亡基因表達(dá)低于B6 DNT,BCL2L11促凋亡基因表達(dá)高于B6 DNT,OX40敲除后NFκB1、P65信號(hào)通路活性降低。IL-2刺激使DNT細(xì)胞OX40表達(dá)增加,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析B6 DNT、B6 DNT+IL-2及OX40 KO DNT+IL-2三組間DNT的活性發(fā)現(xiàn),加入IL-2后DNT增殖增加、凋亡減少,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-x L、Survivin表達(dá)上調(diào),而當(dāng)IL-2刺激OX40 KO DNT細(xì)胞時(shí),其增殖減少、凋亡增加,且上述抗凋亡基因表達(dá)出現(xiàn)一定程度的下降。IL-2刺激可導(dǎo)致DNT細(xì)胞內(nèi)PPARγ下調(diào),同時(shí)PPARγ激動(dòng)劑可使DNT細(xì)胞表面OX40表達(dá)降低,增殖減少,凋亡增加,Bcl-2、Bcl-x L抗凋亡基因表達(dá)下降,BCL2L11促凋亡基因表達(dá)上升。結(jié)論:1.OX40共刺激信號(hào)可增加DNT細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。2.OX40共刺激分子通過(guò)NF-κB信號(hào)通路上調(diào)Bcl-2、Bcl-x L、Survivin抗凋亡基因,并下調(diào)BCL2L11促凋亡基因表達(dá),促進(jìn)DNT增殖、減少凋亡。3.IL-2可以通過(guò)直接調(diào)控OX40表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)DNT細(xì)胞增殖,減少凋亡的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1559609