本文選題：流感病毒　切入點(diǎn)：免疫記憶　出處：《中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：固有免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗流感病毒的第一道防線,在控制和清除流感病毒及啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)為固有免疫細(xì)胞,是固有免疫系統(tǒng)的重要組分。流感病毒是一種常見(jiàn)的呼吸道感染病毒,是造成機(jī)體患流行性感冒的主要病原體。流感病毒感染呼吸道上皮細(xì)胞后,首先啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答。NK細(xì)胞在流感病毒感染中,一方面促進(jìn)病毒的清除,發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的作用;另一方面會(huì)導(dǎo)致免疫病理?yè)p傷,促進(jìn)疾病發(fā)生。因此NK細(xì)胞在抗流感病毒感染中扮演雙重角色。雖然NK細(xì)胞被歸類為固有免疫細(xì)胞,近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明NK細(xì)胞能像適應(yīng)性免疫細(xì)胞—T和B細(xì)胞一樣,具有免疫記憶、長(zhǎng)期存活并介導(dǎo)再次免疫應(yīng)答的能力。早期研究發(fā)現(xiàn)半抗原可以誘導(dǎo)記憶性NK細(xì)胞并誘發(fā)接觸性超敏反應(yīng);小鼠巨細(xì)胞病毒(mCMV)感染和細(xì)胞因子的體外刺激也可以誘導(dǎo)出記憶性NK細(xì)胞。而近期的研究發(fā)現(xiàn),小鼠的單純皰疹病毒(HSV)、人巨細(xì)胞病毒(hCMV)、靈長(zhǎng)類免疫缺陷病毒(SIV)等也可以誘導(dǎo)出記憶性NK細(xì)胞。是否能形成針對(duì)小鼠流感病毒的記憶性NK細(xì)胞以及相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制,目前還知之甚少。在本論文中,我們建立小鼠流感病毒滴鼻感染模型。利用該模型探討流感病毒感染中記憶性NK細(xì)胞的表型和功能。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流感病毒感染中肺臟和肝臟NK細(xì)胞的表型;通過(guò)用滅活流感病毒進(jìn)行體外刺激檢測(cè)NK細(xì)胞的抗原特異性;通過(guò)RT-PCR和MDCK細(xì)胞-免疫組化方法檢測(cè)小鼠肺臟組織中流感病毒的滴度;通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證記憶性NK細(xì)胞的功能。最后通過(guò)流感病毒的滴鼻感染和滅活流感病毒的皮下免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rag1-/-鼠中記憶性NK細(xì)胞的形成和效應(yīng)功能。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.流感病毒感染快速活化肺臟NK細(xì)胞我們用鼠肺適應(yīng)株流感病毒A/PR/8/34(簡(jiǎn)稱PR8)滴鼻處理C57BL/6鼠,在感染第3天發(fā)現(xiàn)肺臟NK細(xì)胞數(shù)目明顯增加,且能快速活化,活化性受體和活化性標(biāo)志表達(dá)上調(diào),抑制性受體略有下降。同時(shí)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ的能力顯著上調(diào)。而且感染1天時(shí)BALF中細(xì)胞因子IFN-α的水平顯著增加。結(jié)果提示,流感病毒能快速招募NK細(xì)胞到肺臟中,并活化NK細(xì)胞,使其參與宿主抗病毒的免疫應(yīng)答。2.NK細(xì)胞的缺陷和清除延遲流感病毒的清除為了證明NK細(xì)胞在流感病毒感染中的效應(yīng)功能,我們分別應(yīng)用C57BL/6鼠、NK細(xì)胞缺陷鼠(Nfil3-/-鼠)和抗體AsGM1清除NK細(xì)胞的C57BL/6鼠,觀察流感病毒感染后機(jī)體清除病毒的功能變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,NK細(xì)胞缺陷和清除的小鼠肺臟病毒的清除都顯著的延遲,小鼠的體重減輕的更快,但是在感染后第3和7天的小鼠肺臟病理?yè)p傷并沒(méi)有顯著差別。結(jié)果提示,NK細(xì)胞在流感病毒感染中具有清除病毒的能力。3.流感病毒感染可誘導(dǎo)出肺臟記憶性NK細(xì)胞但保護(hù)效應(yīng)較弱通過(guò)檢測(cè)流感病毒感染30天后的肺臟NK細(xì)胞表面記憶性相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)變化,我們發(fā)現(xiàn)流感病毒感染誘導(dǎo)肺臟NK細(xì)胞上Ly6c和KLRG1表達(dá)上調(diào),CD62L表達(dá)下調(diào),呈現(xiàn)記憶性表型。通過(guò)滅活病毒的體外刺激實(shí)驗(yàn),表明流感病毒感染30天后的肺臟NK細(xì)胞是流感病毒特異性的。給naive C57BL/6鼠轉(zhuǎn)輸病毒特異性的肺臟NK細(xì)胞可以略微減輕小鼠體重的下降程度,但對(duì)小鼠的生存率沒(méi)有影響。結(jié)果提示流感病毒感染能誘導(dǎo)出肺臟記憶性NK細(xì)胞,但肺臟記憶性NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)輸對(duì)流感病毒感染的保護(hù)效應(yīng)較弱。4.流感病毒感染能快速活化肝臟NK細(xì)胞在流感病毒感染第3天我們對(duì)小鼠肝臟NK細(xì)胞的活化程度和功能進(jìn)行分析,結(jié)果表明與肺臟NK細(xì)胞相似,肝臟NK細(xì)胞也能快速活化,且分泌IFN-γ的能力增加。但在肝臟中未檢測(cè)到流感病毒,而感染24小時(shí)后血清和BALF中IFN-α的水平明顯增加,這提示可能流感病毒感染誘導(dǎo)肺臟產(chǎn)生的IFN-α等細(xì)胞因子活化了肝臟NK細(xì)胞。5.肝臟NK細(xì)胞呈現(xiàn)記憶性表型且保護(hù)效應(yīng)較強(qiáng)我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和體外刺激實(shí)驗(yàn)探討流感病毒感染中活化的肝臟NK細(xì)胞是否具有記憶性,結(jié)果表明流感病毒感染30天后的肝臟NK細(xì)胞也呈現(xiàn)記憶性表型,且是流感病毒特異性的。給naive C57BL/6鼠轉(zhuǎn)輸病毒特異性肝臟NK細(xì)胞能顯著減輕小鼠體重的下降程度,并增加小鼠的生存率。這些結(jié)果表明肝臟記憶性NK細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)強(qiáng)于肺臟記憶性NK細(xì)胞。6.肝臟DX5-CD49a+ NK細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)流感病毒的免疫記憶進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)流感病毒感染誘導(dǎo)出的肝臟記憶性NK細(xì)胞主要為DX5-CD49a+ NK細(xì)胞,且記憶相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Hopx)表達(dá)上調(diào)。用滅活流感病毒刺激時(shí)這群NK細(xì)胞的功能增強(qiáng)。將病毒特異性的肝臟DX5-CD49a+ NK細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給Rag1-/-鼠,能顯著降低肺臟中流感病毒的滴度;而給naive C57BL/6鼠轉(zhuǎn)輸病毒特異性肝臟DX5-CD49a+ NK細(xì)胞能顯著增加小鼠的生存率。這些結(jié)果提示肝臟DX5-CD49a+ NK細(xì)胞介導(dǎo)了對(duì)流感病毒的免疫記憶。7.滅活流感病毒皮下免疫誘導(dǎo)Rag1-/-鼠中形成記憶性NK細(xì)胞通過(guò)用滅活流感病毒皮下免疫Rag1-/-鼠發(fā)現(xiàn),在Rag1-/-鼠也能誘導(dǎo)出記憶性NK細(xì)胞,再次病毒感染時(shí)發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)。進(jìn)一步在Rag1-/-Nfil3-/-鼠和Rag1-/-tbx21-/-鼠中發(fā)現(xiàn),也是肝臟DX5-CD49a+ NK細(xì)胞具有記憶性功能。這些結(jié)果提示記憶性NK細(xì)胞的形成不依賴于T和B細(xì)胞,Rag1-/-鼠中形成的記憶性NK細(xì)胞也定居于肝臟。綜上所述,我們?cè)谛∈蠛粑懒鞲胁《靖腥灸Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)記憶性NK細(xì)胞的存在。記憶性NK細(xì)胞具有流感病毒特異性,主要存在于肝臟中,且主要是肝臟DX5-CD49a+NK細(xì)胞介導(dǎo)了對(duì)流感病毒的免疫記憶。因此,流感病毒感染模型為研究記憶性NK細(xì)胞形成、遷移和功能提供一個(gè)合適的平臺(tái)。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Vivek Bhat;Amit Joshi;Rahul Sarode;Preeti Chavan;;Cytomegalovirus infection in the bone marrow transplant patient[J];World Journal of Transplantation;2015年04期

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本文編號(hào)：1559135