發(fā)布時(shí)間：2018-03-02 21:43

  本文選題：沙門氏菌　切入點(diǎn)：C1血清組特異基因　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：沙門氏菌(Salmonella)是一種重要的食源性致病菌,由其引發(fā)的食物中毒病例在世界范圍內(nèi)居首位。依據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的差異,可將該菌分為46個(gè)血清組,2600多個(gè)血清型,能夠感染人類的致病菌株主要集中在A、B、C1、C2和D血清組中,其中,C1血清組包含多個(gè)高致病性的沙門氏菌血清型(如豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和嬰兒沙門氏菌等)。O7抗原是C1血清組所特有的抗原,但是,對(duì)其形成的遺傳途徑卻知之甚少。本課題組前期依托沙門氏菌基因組學(xué)和生物信息學(xué)平臺(tái),采用比較基因組學(xué)的方法挖掘出沙門氏菌C1血清組的7個(gè)特異基因。這些C1血清組特異基因的編碼產(chǎn)物全部為功能未知的蛋白,如:SC2092、SC0368和SC0595,這三個(gè)基因編碼含有多個(gè)跨膜域的膜蛋白。對(duì)它們功能的分析將進(jìn)一步揭示C1血清組特有O7抗原合成的遺傳途徑,并為闡明血清型與基因型的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究采用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)了沙門氏菌C1血清組特異基因與編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列、二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及其功能;采用同源重組的方法,構(gòu)建了基因缺失突變株,通過(guò)評(píng)價(jià)突變株在血清凝集、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)能力等多個(gè)方面的變化,得到了受到特異基因缺失影響的生物學(xué)通路;再利用RTqPCR和RNAseq技術(shù),在轉(zhuǎn)錄水平上,探討了受到C1血清組特異基因影響的關(guān)鍵基因與調(diào)控通路,并檢測(cè)了差異基因的表達(dá)情況。綜合上述結(jié)果,本研究得到沙門氏菌C1血清組特異基因的功能和/或?qū)1血清組菌株(以豬霍亂沙門氏菌為代表菌株)的生物學(xué)特征的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)基因功能從ncbi網(wǎng)站(http://ncbi.nlm.nih.gov/)上,分別下載了c1血清組特異基因sc2092、sc0368和sc0595的核苷酸與對(duì)應(yīng)的氨基酸序列,使用blastn(p)軟件對(duì)它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行同源比對(duì),再使用topcons軟件對(duì)三個(gè)膜蛋白進(jìn)行拓?fù)涠?jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明:a)這些基因的核苷酸及其對(duì)應(yīng)氨基酸在沙門氏菌c1血清組中具有高度的序列保守性和特異性,僅在屬于c1血清組的菌株中存在,而在其它的沙門氏菌血清組或其它非沙門氏菌菌株中不存在;b)特異基因sc2092,位于o抗原基因簇上,編碼具有12個(gè)跨膜域的膜蛋白(o抗原翻轉(zhuǎn)酶wzx的重要特征之一),與鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌的wzx/wzx相比,雖然序列的同源性極低,僅分別為0.8%/23%和4%/24%,但拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)卻高度相似(o抗原翻轉(zhuǎn)酶wzx的另一重要特征),體現(xiàn)在:在topcons軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果中,采用不同的算法預(yù)測(cè)三個(gè)wzx蛋白的n端和c端均在細(xì)胞質(zhì)側(cè),而使用同一算法時(shí),它們的跨膜域數(shù)目和間隔環(huán)有著幾乎完全相同的結(jié)果;c)特異基因sc0368和sc0595,位于o抗原基因簇外,編碼含10個(gè)跨膜域的膜蛋白,它們的序列具有高度的同源性,核苷酸的同源性為87%,氨基酸的同源性為83%,并且具有幾乎完全一致的二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。2)同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建與缺失突變株的篩選依據(jù)巢式pcr的原理設(shè)計(jì)特異引物,經(jīng)過(guò)兩輪pcr擴(kuò)增獲得同源臂片段;通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法,在2500v,5ms的條件下,將同源臂片段連接于高效蔗糖自殺質(zhì)粒pre112,成功獲得同源重組質(zhì)粒pre△wzxc1,pre△0368與pre△0595;采用兩步同源重組法(共結(jié)合和蔗糖篩選),以野生型為親本菌,獲得無(wú)標(biāo)記缺失突變株△wzxc1、△0368和△0595,以△0368突變株為親本菌,獲得無(wú)標(biāo)記雙突變株△0368△0595。突變株的獲得為后期生物學(xué)特征的比較和高通量rna測(cè)序(rnaseq)提供了實(shí)驗(yàn)材料。3)c1血清組特異基因與表面抗原的相關(guān)性分析采用血清玻片凝集和脂多糖(lps)sds-page電泳檢測(cè)相結(jié)合的方法,來(lái)分析缺失突變株菌體表面抗原的變化情況。結(jié)果顯示:a)特異基因sc2092缺失突變株不能形成完整的lps(o抗原區(qū)域全部缺失),該突變株與o7抗血清的凝集反應(yīng)表現(xiàn)為陰性,抗原的變化結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相符,因此,該基因在本課題中被命名為wzxc1;b)特異基因sc0368和sc0595的缺失突變株(△0368、△0595和△0368△0595)與o7抗血清的凝集反應(yīng)均表現(xiàn)為陽(yáng)性,并且,與野生型相比,在三個(gè)突變株的lps凝膠電泳圖上未發(fā)現(xiàn)顯著的可見差異,表明這兩個(gè)基因的缺失都未導(dǎo)致o7抗原合成受阻,然而,基因sc0368的缺失(突變株△0368和△0368△0595)卻影響了hc抗原的合成,即與hc抗血清的凝集反應(yīng)表現(xiàn)為陰性。4)c1血清組特異基因缺失突變株的表型特征檢測(cè)a)沙門氏菌c1血清組特異基因sc2092(wzxc1)的缺失,使細(xì)菌缺乏在固體培養(yǎng)基表面的蠕動(dòng)能力和半固體瓊脂中的游動(dòng)能力,電子顯微鏡檢測(cè)和rt-qpcr的分析結(jié)果表明,自凝聚能力的增強(qiáng)和鞭毛合成相關(guān)基因表達(dá)量的下降是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)缺陷的主要原因。另外,wzxc1突變株對(duì)nacl更加敏感,一旦在培養(yǎng)基中添加1%的nacl,突變株細(xì)胞即呈現(xiàn)自凝聚現(xiàn)象,但是在無(wú)nacl添加的培養(yǎng)基中,突變株△wzxc1的運(yùn)動(dòng)缺陷、自凝聚和鞭毛合成相關(guān)基因表達(dá)量下降現(xiàn)象都會(huì)得到恢復(fù)。因此,本研究提出了“wzxc1缺失引發(fā)nacl依賴型運(yùn)動(dòng)缺陷”的新理論;b)沙門氏菌c1血清組特異基因sc0368的缺失,導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)速度的提高,但是運(yùn)動(dòng)能力卻喪失。在細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期,突變株△0368和△0368△0595的生長(zhǎng)量(ca.1010cfu/ml)比野生型和△0595(ca.108cfu/ml)的生長(zhǎng)量高2個(gè)數(shù)量級(jí);鞭毛銀染、電鏡檢測(cè)和運(yùn)動(dòng)性(蠕動(dòng)與游動(dòng))分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明,在基因sc0368缺失突變株(△0368和△0368△0595)中,鞭毛不能合成,細(xì)菌不能運(yùn)動(dòng);c)沙門氏菌C1血清組特異基因SC0595的缺失,未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的生物學(xué)特征有明顯影響。5)RNAseq與RT-qPCR方法分析差異表達(dá)基因?yàn)榱烁娴牧私釩1血清組特異基因SC0368與SC0595對(duì)細(xì)菌的影響和兩個(gè)基因之間的關(guān)系,本研究利用高通量的RNAseq技術(shù)分析了△0368、△0595與△0368△0595突變株與野生型菌株相比的表達(dá)差異基因,并采用RT-q PCR方法對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明:a)C1血清組特異基因SC0368和SC0595在LPS的合成過(guò)程中具有協(xié)同作用,只有它們同時(shí)缺失(△0368△0595 vs.野生型)才會(huì)導(dǎo)致與LPS核心合成相關(guān)的6個(gè)基因表達(dá)量的顯著下調(diào);b)在突變株△0368和△0368△0595中,與鞭毛合成以及與細(xì)菌趨化能力相關(guān)的兩條通路中20個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)大幅度下調(diào),這些基因?qū)儆诒廾铣杉?jí)聯(lián)效應(yīng)的第三組(class 3),而fli A基因(編碼σ28轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)是第三組的首要啟動(dòng)基因,它極有可能是首先受到SC0368基因影響的關(guān)鍵因子。綜上所述,本研究從生物信息學(xué)預(yù)測(cè),缺失突變株表型驗(yàn)證及其轉(zhuǎn)錄水平(RNAseq與RT-qPCR)對(duì)比分析三個(gè)角度,逐層探討了沙門氏菌C1血清組特異基因SC2092、SC0368和SC0595的功能及其對(duì)C1血清組代表菌株(豬霍亂沙門氏菌)生物學(xué)特征的影響。本研究將沙門氏菌血清組特異基因與O抗原/LPS的合成建立了聯(lián)系,為揭示血清型與基因型的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。特異基因缺失突變株的表型變化結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平的差異分析數(shù)據(jù),豐富了細(xì)菌生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、粘附等現(xiàn)象的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究中獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為更好地了解沙門氏菌C1血清組特征,特別是其共有抗原的形成過(guò)程具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1558201