本文關鍵詞： 布拉酵母菌 β-葡聚糖 基因敲除 益生功能 DSS　出處：《山東農業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：布拉酵母菌(Saccharomyces.boulardii)是1920年由法國科學家Henri Boulard從印尼荔枝等水果中分離得到的一種益生性酵母菌。在歐美、非洲等國家地區(qū),布拉酵母菌(Sb)已經做為微生態(tài)制劑廣泛用于預防和治療嬰幼兒腹瀉、旅行者腹瀉、腸道手術后恢復及腸道環(huán)境平衡的調節(jié)。布拉酵母菌已經成為最有價值的益生菌之一。對布拉酵母菌大量研究主要集中在生產和臨床使用,對其抗炎及免疫調節(jié)的分子機制研究相對較少,以及對其遺傳改造以提高其益生作用和效果也少有研究和報道。為了研究布拉酵母菌抗炎作用及提高其益生效果,我們通過敲除布拉酵母菌VRP1基因,構建β-葡聚糖含量升高的缺失變異菌株,對比研究THP1基因缺失突變株(Sb-thp1)和VRP1基因缺失變異株(Sb-vrp1)的形態(tài)大小、細胞壁結構、生長速度等表型,對基因缺失突變株進行安全性評價,通過DSS腸炎來研究布拉酵母菌及其缺失變異株預防腸炎能力,篩選益生能力較好的菌株,并對益生機制進行探討。1.布拉酵母菌VRP1基因缺失變異株的構建酵母菌β-葡聚糖占母菌細胞壁組成的50%以上,是一種很好的天然免疫增強劑,能提高機體的非特異性和特異性免疫作用,因此構建、篩選高含量β-葡聚糖的布拉菌變異株能豐富β-葡聚糖的自然資源,拓寬布拉酵母菌應用領域。我們應用本實驗室布拉酵母菌Cre-lox P基因敲除系統(tǒng),把VRP1基因從布拉酵母菌基因組中完全刪除,利用PCR鑒定基因敲除株,獲得VRP1基因缺失變異株。2.布拉酵母菌及其基因缺失變異株的表型研究我們對布拉酵母菌野株及其基因缺失變異株表型進行對比研究,包括形態(tài)大小、細胞壁組成、生長速度、細胞壁敏感性、體外對人工胃酸、膽汁鹽的耐受性及小鼠體內滯留情況等。掃描電鏡觀察發(fā)現,與Sb比較,Sb-thp1變圓,而Sb-vrp1變得細長。透射電鏡觀察發(fā)現,與Sb、Sb-thp1相比,Sb-vrp1總細胞壁厚度分別增加13.4%和10.7%;甘露聚糖單層厚度分別增加25.1%和19.5%;葡聚糖單層厚度分別增加10.9%和4.2%。與Sb相比,Sb-vrp1生長速度無差別,Sb-thp1生長速度減慢。在對剛果紅的敏感性上,Sb、Sb-thp1和Sb-vrp1細胞壁之間比較沒有差別。在體外抗不同pH胃酸試驗中,Sb、Sb-thp1和Sb-vrp1存活率比較差異不顯著;在體外抗不同濃度膽汁鹽試驗中,Sb-vrp1存活率顯著高于Sb和Sb-thp1。小鼠體內滯留試驗發(fā)現,與Sb比較,Sb-thp1和Sb-vrp1滯留時間分別多8h和12h。綜上所述,從布拉酵母菌基因組敲除VRP1和THP1基因會對布拉酵母菌表型產生一定程度的影響。3.布拉酵母菌基因缺失株安全性評價通過急性毒性試驗和慢性重復性試驗,對基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1進行安全性評估。結果發(fā)現,基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1在一次性大劑量(2×109個菌)急性毒性試驗中,動物臨床表現、體重變化、臟器及血液指標等方面與正常組沒有差別,機體沒有表現出任何毒性反應。將基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1分高(2×108個菌)、中(1×108個菌)、低(2×107個菌)三種劑量,每天灌服小鼠,連續(xù)進行二十八天的慢性重復性毒性試驗。與對照組比較,基因缺失株各劑量組,在臨床表現、體重變化、臟器及血液指標等方面沒有區(qū)別。另外,同一菌種,劑量高低對機體正常生理、血液指標沒有影響,而且同一劑量的不同菌株,也沒有表現出差別。以上這些結果表明基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1對小鼠是安全的。4.dss結腸炎動物模型的建立dss急性結腸炎動物模型是研究人自然結腸炎常用的模型,重復性好,容易操作,被廣泛使用。為了研究布拉酵母菌及其缺失變異株預防治療結腸炎的作用,我們選擇6周齡c57bl/6j雌性小鼠為試驗動物,來建立dss結腸炎動物模型,對dss使用劑量、檢測指標進一步試驗,探討最佳的試驗條件。結果表明,3%dss連續(xù)飲用8天能成功建立dss急性結腸炎動物模型;以疾病活動指數和病理組織學得分作為評價標準來評價dss結腸炎;疾病活動指數是體重損失得分與潛血得分的平均數。當體重沒有變化或者上升時,體重損失得分為0;當體重下降1?5%,體重損失得分為1;當體重下降5?10%,體重損失得分為2;當體重下降10?15%,體重損失得分為3;當體重下降超過15%,體重損失得分為4。糞便正常均一沒有潛血,潛血得分為0;糞便柔軟帶有潛血,潛血得分為1;非常柔軟并帶有血跡,潛血得分為2;糞便水樣帶有可見直腸出血,潛血得分為3;嚴重血便,潛血得分為4。病理組織學得分根據淋巴細胞侵潤和上皮黏膜損傷程度來計算。沒有淋巴細胞侵潤和腸道上皮黏膜完整正常,病理組織得分為0;有少量的淋巴細胞侵潤,病理組織得分為1;中性粒細胞侵潤和黏膜輕度水腫,病理組織得分為2;腸道黏膜局灶性糜爛和潰瘍,病理組織得分為3;腸道黏膜大的多處潰瘍,病理組織得分為4;腸道黏膜結構完全破壞,病理組織得分為5。5.布拉酵母菌及其基因缺失變異株對dss結腸炎的預防作用我們通過dss結腸炎模型來研究布拉酵母菌及其基因缺失變異株對dss結腸炎的預防作用。對4周齡c57bl/6j雌性小鼠每只每天分別灌胃108個布拉酵母菌及其基因突變變異株,連續(xù)進行22天,從第14天開始連續(xù)8天使用3%DSS誘導結腸炎,觀察布拉酵母菌及其基因缺失突變株預防作用。我們分析了布拉酵母菌及其基因缺失突變株對DSS腸炎預防效果,對小鼠炎癥因子和屏障相關基因表達及免疫系統(tǒng)的影響。Sb-vrp1和Sb-thp1能夠下調DSS結腸炎疾病活動指數,減輕結腸病理組織損傷,緩解結腸病變,并能使脾臟指數和MPO酶活力接近于對照組。通過RT-PCR檢測,發(fā)現Sb-vrp1能下調結腸中促炎因子IL-6、IL-17、iNOS、TNF-α、MMP-2和MMP-9等基因表達,上調MUC-2、ZO-1和Occludin等腸道屏障相關基因的表達,從而達到減輕炎癥,增強腸壁的屏障作用,來達到預防效果。布拉酵母菌及其基因缺失變異株能夠調節(jié)抗體水平,其中Sb-vrp1使正常小鼠SIgA濃度水平升高175%,使DSS腸炎小鼠SIgA濃度水平升高61.7%,同時對腸系膜淋巴結中淋巴細胞比例也產生影響。在DSS結腸炎中,Sb-vrp1可有效下調MLN中B淋巴細胞群和CD4+CD25+T淋巴細胞群比例,上調T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞亞群和CD4+T淋巴細胞亞群比例,來維持免疫系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定。這些結果說明布拉酵母菌及其基因缺失變異株對小鼠細胞免疫和體液免疫具有一定影響,可能通過SIgA和腸系膜淋巴結中的T淋巴細胞群及其亞群的變化來緩解DSS腸炎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R371

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 趙國旺;付萍;;調節(jié)性T細胞分化調節(jié)研究進展[J];皮膚病與性病;2016年06期

2 張迎娣;余婷婷;朱云娟;趙小靜;程秀琴;張紅杰;;雙歧桿菌三聯活菌對DSS誘導結腸炎鼠腸緊密連接蛋白JAM-1的影響[J];世界華人消化雜志;2016年02期

3 林海珊;歐敏;;誘導型一氧化氮合成酶及其相關分子的研究進展[J];現代醫(yī)學;2015年05期

4 余晶儀;郝小燕;龍敏;王勤;屈婭榮;溫揚明;張文炳;羅軍;曹虹;;MUC2基因表達對益生菌調節(jié)腸屏障作用的影響[J];南方醫(yī)科大學學報;2013年02期

5 姚君;王立生;師瑞月;王建堯;李迎雪;張茹;莫鏡;;雙歧桿菌對潰瘍性結腸炎小鼠外周血和腸系膜淋巴結CD4~+ CD25~+ Foxp3~+調節(jié)T細胞表達的影響[J];中國微生態(tài)學雜志;2011年09期

6 彭洪;林中超;王程頡;楊祖奎;;IL-4和IL-6在潰瘍性直腸炎中的表達及其意義[J];西部醫(yī)學;2010年12期

7 Sahar K Hegazy;Mohamed M El-Bedewy;;Effect of probiotics on pro-inflammatory cytokines and NF-κB activation in ulcerative colitis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年33期

8 Lynne V McFarland;;Systematic review and meta-analysis of Saccharomyces boulardii in adult patients[J];World Journal of Gastroenterology;2010年18期

9 AG Billoo;MA Memon;SA Khaskheli;G Murtaza;Khalid Iqbal;M Saeed Shekhani;Ahson Q Siddiqi;;Role of a probiotic (Saccharomyces boulardii) in management and prevention of diarrhoea[J];World Journal of Gastroenterology;2006年28期

10 Stéphane M Schneider;Fernand Girard-Pipau;Jér(o|^)me Filippi;Xavier Hébuterne;Dominique Moyse;Gustavo Calle Hinojosa;Anne Pompei;Patrick Rampal;;Effects of Saccharomycesboulardiion fecal short-chain fatty acids and microflora in patients on long-term total enteral nutrition[J];World Journal of Gastroenterology;2005年39期

相關博士學位論文 前1條

1 汪路曼;B細胞在炎癥性腸病中的調節(jié)作用及其機制研究[D];復旦大學;2013年

相關碩士學位論文 前2條

1 何菲菲;布拉氏酵母菌細胞壁高含量β-葡聚糖菌株的構建及功能的研究[D];山東農業(yè)大學;2015年

2 王龍江;布拉氏酵母菌基因敲除系統(tǒng)的構建及初步應用[D];山東農業(yè)大學;2014年

，

本文編號：1539986