本文關(guān)鍵詞： 布拉酵母菌 β-葡聚糖 基因敲除 益生功能 DSS　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：布拉酵母菌(Saccharomyces.boulardii)是1920年由法國(guó)科學(xué)家Henri Boulard從印尼荔枝等水果中分離得到的一種益生性酵母菌。在歐美、非洲等國(guó)家地區(qū),布拉酵母菌(Sb)已經(jīng)做為微生態(tài)制劑廣泛用于預(yù)防和治療嬰幼兒腹瀉、旅行者腹瀉、腸道手術(shù)后恢復(fù)及腸道環(huán)境平衡的調(diào)節(jié)。布拉酵母菌已經(jīng)成為最有價(jià)值的益生菌之一。對(duì)布拉酵母菌大量研究主要集中在生產(chǎn)和臨床使用,對(duì)其抗炎及免疫調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究相對(duì)較少,以及對(duì)其遺傳改造以提高其益生作用和效果也少有研究和報(bào)道。為了研究布拉酵母菌抗炎作用及提高其益生效果,我們通過(guò)敲除布拉酵母菌VRP1基因,構(gòu)建β-葡聚糖含量升高的缺失變異菌株,對(duì)比研究THP1基因缺失突變株(Sb-thp1)和VRP1基因缺失變異株(Sb-vrp1)的形態(tài)大小、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)速度等表型,對(duì)基因缺失突變株進(jìn)行安全性評(píng)價(jià),通過(guò)DSS腸炎來(lái)研究布拉酵母菌及其缺失變異株預(yù)防腸炎能力,篩選益生能力較好的菌株,并對(duì)益生機(jī)制進(jìn)行探討。1.布拉酵母菌VRP1基因缺失變異株的構(gòu)建酵母菌β-葡聚糖占母菌細(xì)胞壁組成的50%以上,是一種很好的天然免疫增強(qiáng)劑,能提高機(jī)體的非特異性和特異性免疫作用,因此構(gòu)建、篩選高含量β-葡聚糖的布拉菌變異株能豐富β-葡聚糖的自然資源,拓寬布拉酵母菌應(yīng)用領(lǐng)域。我們應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室布拉酵母菌Cre-lox P基因敲除系統(tǒng),把VRP1基因從布拉酵母菌基因組中完全刪除,利用PCR鑒定基因敲除株,獲得VRP1基因缺失變異株。2.布拉酵母菌及其基因缺失變異株的表型研究我們對(duì)布拉酵母菌野株及其基因缺失變異株表型進(jìn)行對(duì)比研究,包括形態(tài)大小、細(xì)胞壁組成、生長(zhǎng)速度、細(xì)胞壁敏感性、體外對(duì)人工胃酸、膽汁鹽的耐受性及小鼠體內(nèi)滯留情況等。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),與Sb比較,Sb-thp1變圓,而Sb-vrp1變得細(xì)長(zhǎng)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),與Sb、Sb-thp1相比,Sb-vrp1總細(xì)胞壁厚度分別增加13.4%和10.7%;甘露聚糖單層厚度分別增加25.1%和19.5%;葡聚糖單層厚度分別增加10.9%和4.2%。與Sb相比,Sb-vrp1生長(zhǎng)速度無(wú)差別,Sb-thp1生長(zhǎng)速度減慢。在對(duì)剛果紅的敏感性上,Sb、Sb-thp1和Sb-vrp1細(xì)胞壁之間比較沒(méi)有差別。在體外抗不同pH胃酸試驗(yàn)中,Sb、Sb-thp1和Sb-vrp1存活率比較差異不顯著;在體外抗不同濃度膽汁鹽試驗(yàn)中,Sb-vrp1存活率顯著高于Sb和Sb-thp1。小鼠體內(nèi)滯留試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與Sb比較,Sb-thp1和Sb-vrp1滯留時(shí)間分別多8h和12h。綜上所述,從布拉酵母菌基因組敲除VRP1和THP1基因會(huì)對(duì)布拉酵母菌表型產(chǎn)生一定程度的影響。3.布拉酵母菌基因缺失株安全性評(píng)價(jià)通過(guò)急性毒性試驗(yàn)和慢性重復(fù)性試驗(yàn),對(duì)基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1進(jìn)行安全性評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn),基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1在一次性大劑量(2×109個(gè)菌)急性毒性試驗(yàn)中,動(dòng)物臨床表現(xiàn)、體重變化、臟器及血液指標(biāo)等方面與正常組沒(méi)有差別,機(jī)體沒(méi)有表現(xiàn)出任何毒性反應(yīng)。將基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1分高(2×108個(gè)菌)、中(1×108個(gè)菌)、低(2×107個(gè)菌)三種劑量,每天灌服小鼠,連續(xù)進(jìn)行二十八天的慢性重復(fù)性毒性試驗(yàn)。與對(duì)照組比較,基因缺失株各劑量組,在臨床表現(xiàn)、體重變化、臟器及血液指標(biāo)等方面沒(méi)有區(qū)別。另外,同一菌種,劑量高低對(duì)機(jī)體正常生理、血液指標(biāo)沒(méi)有影響,而且同一劑量的不同菌株,也沒(méi)有表現(xiàn)出差別。以上這些結(jié)果表明基因缺失株sb-vrp1與sb-thp1對(duì)小鼠是安全的。4.dss結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立dss急性結(jié)腸炎動(dòng)物模型是研究人自然結(jié)腸炎常用的模型,重復(fù)性好,容易操作,被廣泛使用。為了研究布拉酵母菌及其缺失變異株預(yù)防治療結(jié)腸炎的作用,我們選擇6周齡c57bl/6j雌性小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物,來(lái)建立dss結(jié)腸炎動(dòng)物模型,對(duì)dss使用劑量、檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)一步試驗(yàn),探討最佳的試驗(yàn)條件。結(jié)果表明,3%dss連續(xù)飲用8天能成功建立dss急性結(jié)腸炎動(dòng)物模型;以疾病活動(dòng)指數(shù)和病理組織學(xué)得分作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)dss結(jié)腸炎;疾病活動(dòng)指數(shù)是體重?fù)p失得分與潛血得分的平均數(shù)。當(dāng)體重沒(méi)有變化或者上升時(shí),體重?fù)p失得分為0;當(dāng)體重下降1?5%,體重?fù)p失得分為1;當(dāng)體重下降5?10%,體重?fù)p失得分為2;當(dāng)體重下降10?15%,體重?fù)p失得分為3;當(dāng)體重下降超過(guò)15%,體重?fù)p失得分為4。糞便正常均一沒(méi)有潛血,潛血得分為0;糞便柔軟帶有潛血,潛血得分為1;非常柔軟并帶有血跡,潛血得分為2;糞便水樣帶有可見(jiàn)直腸出血,潛血得分為3;嚴(yán)重血便,潛血得分為4。病理組織學(xué)得分根據(jù)淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)和上皮黏膜損傷程度來(lái)計(jì)算。沒(méi)有淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)和腸道上皮黏膜完整正常,病理組織得分為0;有少量的淋巴細(xì)胞侵潤(rùn),病理組織得分為1;中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)和黏膜輕度水腫,病理組織得分為2;腸道黏膜局灶性糜爛和潰瘍,病理組織得分為3;腸道黏膜大的多處潰瘍,病理組織得分為4;腸道黏膜結(jié)構(gòu)完全破壞,病理組織得分為5。5.布拉酵母菌及其基因缺失變異株對(duì)dss結(jié)腸炎的預(yù)防作用我們通過(guò)dss結(jié)腸炎模型來(lái)研究布拉酵母菌及其基因缺失變異株對(duì)dss結(jié)腸炎的預(yù)防作用。對(duì)4周齡c57bl/6j雌性小鼠每只每天分別灌胃108個(gè)布拉酵母菌及其基因突變變異株,連續(xù)進(jìn)行22天,從第14天開(kāi)始連續(xù)8天使用3%DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎,觀察布拉酵母菌及其基因缺失突變株預(yù)防作用。我們分析了布拉酵母菌及其基因缺失突變株對(duì)DSS腸炎預(yù)防效果,對(duì)小鼠炎癥因子和屏障相關(guān)基因表達(dá)及免疫系統(tǒng)的影響。Sb-vrp1和Sb-thp1能夠下調(diào)DSS結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù),減輕結(jié)腸病理組織損傷,緩解結(jié)腸病變,并能使脾臟指數(shù)和MPO酶活力接近于對(duì)照組。通過(guò)RT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Sb-vrp1能下調(diào)結(jié)腸中促炎因子IL-6、IL-17、iNOS、TNF-α、MMP-2和MMP-9等基因表達(dá),上調(diào)MUC-2、ZO-1和Occludin等腸道屏障相關(guān)基因的表達(dá),從而達(dá)到減輕炎癥,增強(qiáng)腸壁的屏障作用,來(lái)達(dá)到預(yù)防效果。布拉酵母菌及其基因缺失變異株能夠調(diào)節(jié)抗體水平,其中Sb-vrp1使正常小鼠SIgA濃度水平升高175%,使DSS腸炎小鼠SIgA濃度水平升高61.7%,同時(shí)對(duì)腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞比例也產(chǎn)生影響。在DSS結(jié)腸炎中,Sb-vrp1可有效下調(diào)MLN中B淋巴細(xì)胞群和CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞群比例,上調(diào)T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群和CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例,來(lái)維持免疫系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定。這些結(jié)果說(shuō)明布拉酵母菌及其基因缺失變異株對(duì)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫具有一定影響,可能通過(guò)SIgA和腸系膜淋巴結(jié)中的T淋巴細(xì)胞群及其亞群的變化來(lái)緩解DSS腸炎。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R371

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1539986