發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 09:21

  本文關(guān)鍵詞： GPCR AT1R TRPC3 β-arrestin TRV120027 Pyr3 兒茶酚胺 嗜鉻細(xì)胞 安培法 Ca~(2+) TRP通道 GPCR 偏向性配體 鈣成像 TRV120027 兒茶酚胺嗜鉻細(xì)胞 安培法　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:血管緊張素Ⅰ型受體(Angiotensin receptor 1 receptor,ATlR)偏向性配體通過激活(;蛋白白依賴的或β-拘禁蛋白依賴的途徑產(chǎn)生不同的效應(yīng)。最近的研究結(jié)果表明,針對(duì)AT1R-拘禁蛋白偏向性途徑的配體對(duì)治療心衰,要比氯沙坦具有更好的療效。但是血管緊張素通過其受體刺激腎上腺髓質(zhì)后產(chǎn)生的腎上腺素和去甲腎上腺素對(duì)某些心血管疾病是不利的。目前AT1R-拘禁蛋白偏向性配體-TRV120027已進(jìn)入三期臨床,所以本實(shí)驗(yàn)主要研究拘禁蛋白介導(dǎo)的AT1R信號(hào)途徑是否影響腎上腺嗜鉻細(xì)胞兒茶酚胺的分泌及其機(jī)制。方法:在本研究中,我們分離雌性小鼠的原代腎上腺嗜鉻細(xì)胞(Mouse Adrenal Chromaffin Cells,MACC),使用特異的G蛋白向性或β-拘禁蛋白偏向性ATlR激動(dòng)劑研究不同偏向性信號(hào)通路對(duì)腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分泌的影響及分子機(jī)制。我們通過電化學(xué)方法和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(enzyme linked immuosorbent assay,ELISA)檢查臨床前藥物TRV120027對(duì)兒茶酚胺分泌的影響,并應(yīng)用信號(hào)通路中小分子抑制劑,野生型或β-arrestin-1、β-arrest in-2、Gq或TRPC3-敲除小鼠,檢測(cè)TRV120027刺激兒茶酚胺分泌的分子機(jī)制。結(jié)果:1.Gq偏向性配體引起MACC分泌ATlR的Gq偏向性配體TRV120055和TRV120056能引起小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞,兒茶酚胺的量子化釋放,并且Gq偏向性激動(dòng)劑(TRV120055,TRV120056)引起的分泌量只占全激動(dòng)劑AngⅡ引起兒茶酚胺分泌量的一半。2.β-拘禁蛋白偏向性配體引起MACC分泌AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體SII、TRV120026和TRV120027能引起小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞兒茶酚胺分泌。并且分析發(fā)現(xiàn)β-拘禁蛋白偏向性激動(dòng)劑(SII、TRV120027和TRV120026)引起的分泌量只占全激動(dòng)劑AngⅡ引起兒茶酚胺分泌量的一半。同時(shí)TRV120027引起的分泌能被AT1R的拮抗劑坎地沙坦(100nM)完全阻斷。3.ELISA檢測(cè)ATlR不同偏向性配體引起的MACC分泌在分離的完整小鼠腎上腺髓質(zhì)上,給予配體刺激1min,用ELISA試劑盒分別檢測(cè)AT1R的不同偏向性配體引起髓質(zhì)分泌腎上腺素(Epinephrine,E)和去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)的情況。AT1R的完全激動(dòng)劑Ang Ⅱ、Gq偏向性配體(TRV120055)和β-拘禁蛋白偏向性配體(SII和TRV120027)短時(shí)間刺激1 min均可引起髓質(zhì)E和NE分泌增多。4.Gq偏向性配體引起MACC的分泌可被U73122阻斷在分離的MACC上,PLC的阻斷劑U73I22(10 μMM)抑制ATlR的全激動(dòng)劑AngⅡ引起的兒茶酚胺分泌,其分泌量降低約有一半;而ATlR的Gq偏向性激動(dòng)劑TRV120055和TRV120056引起MACC分泌后,再給予U73122后,無法檢測(cè)到兒茶酚胺的分泌,說明U73122完全阻斷了ATlR的Gq偏向性激動(dòng)劑引起的MACC的分泌。5.β-拘禁蛋白偏向性配體引起MACC的分泌不能被U73122阻斷在培養(yǎng)的單個(gè)的MACC上,分別給予ATlR的β-拘禁蛋白偏向性配體SII、TRV120027或TRV120026,檢測(cè)MACC兒茶酚胺分泌,給10μM U73122阻斷6min后,再給AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體后,兒茶酚胺分泌量并未下降。因此,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體引起的MACC分泌不能被U73122阻斷。6.TRV120027引起的MACC兒茶酚胺分泌非Gq途徑在分離培養(yǎng)的Gq-基因敲除小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞上,給予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027,可引起Gq敲除的MACC兒茶酚胺分泌,同時(shí)比較Gq敲除的和野生的MACC的兒茶酚胺釋放量無明顯差異,進(jìn)一步證實(shí)TRV120027引起的MACC兒茶酚胺分泌不需要激活Gq途徑,是非Gq依賴的。7.TRV120027引起的MACC兒茶酚胺分泌非Gi途徑實(shí)驗(yàn)中選擇Gi的抑制劑百日咳毒素(pertussis toxin,PTX),用1μM PTX預(yù)孵育嗜鉻細(xì)胞后,再給予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027,仍可檢測(cè)到MACC兒茶酚胺分泌,同時(shí)比較加入PTX的和未加入PTX孵育的MACC兒茶酚胺釋放量無明顯差異,提示TRV120027引起的MACC兒茶酚胺分泌是非Gi依賴的。8.β-arrestin-1介導(dǎo)TRV120027引起MACC的兒茶酚胺分泌實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)β-arrestin-2基因敲除小鼠的嗜鉻細(xì)胞,給予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027,嗜鉻細(xì)胞分泌良好,比較β-arrestin-2-/-敲除的和野生型(Wild type,WT)的MACC的兒茶酚胺釋放量無明顯差異。由結(jié)果可知,β-arrestin-2-敲除不影響TRV120027引起MACC的兒茶酚胺分泌。然而,同樣分離培養(yǎng)β-arrestin-1-基因敲除小鼠的嗜鉻細(xì)胞,給予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027后,卻未引起嗜鉻細(xì)胞兒茶酚胺的量子化釋放,比較β-arrestin-1敲除的和WT的MACC的兒茶酚胺釋放量差異非常顯著。由結(jié)果可知β-arrestin-1介導(dǎo)了 TRV120027引起MACC的兒茶酚胺分泌。9.TRV120027引起MACC兒茶酚胺的分泌依賴于細(xì)胞外鈣離子實(shí)驗(yàn)中使MACC在標(biāo)準(zhǔn)含鈣離子溶液和無鈣離子的外液之間進(jìn)行切換的方法,當(dāng)給予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體SII和TRV120027 后,在標(biāo)準(zhǔn)含鈣離子溶液可引起MACC的分泌;而切換到無鈣離子的外液時(shí),SII和TRV120027均未引起MACC兒茶酚胺的分泌,由此可知TRV120027引起MACC兒茶酚胺的分泌依賴于細(xì)胞外的鈣離子。10.TRPC3敲除后,影響TRV120027引起MACC兒茶酚胺的分泌實(shí)驗(yàn)中分別分離培養(yǎng)TRPC3 TRPC6 TRPC7和TRPC3 TRPC6 TRPC7基因敲除小鼠的嗜鉻細(xì)胞,當(dāng)給予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027后,可引起TRPC3+-TRPC6 TRPC7-的MACC兒茶酚胺的分泌卻口不能引起TRPC3 TRPC6 TRPC7-的MACC兒茶酚胺的分泌,二者兒茶酚胺釋放量差異非常顯著(p0.005)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)只敲除TRPC3基因的小鼠的嗜鉻細(xì)胞,給予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027后,也未引起MACC兒茶酚胺的量子化釋放,比較TRPC3-敲除的和WT的MACC的兒茶酚胺釋放量差異非常顯著(p0.005),以上結(jié)果證實(shí)AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027激活TRPC3通道導(dǎo)致鈣內(nèi)流引起MACC的兒茶酚胺分泌。11.β-arrestin-1-TRPC3途徑在是不同GPCR激動(dòng)劑誘導(dǎo)分泌中的一般通路。實(shí)驗(yàn)中選用不同G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)激動(dòng)劑激動(dòng)劑,包括氯化乙酰甲膽堿(Methacholine Chloride,Mch)、硫酸化八肽膽囊收縮素(sulfated cholecystokininoctapeptide,CCK-8s)和縮宮素(Oxytocin 0T),激活MACC上的相應(yīng)受體后均引起兒茶酚胺的分泌。而且0T和CCK-8s引起的MACC兒茶酚胺的分泌被U73122阻斷后,分泌量分別降為80%和50%。當(dāng)同時(shí)應(yīng)用TRPC3通道阻斷劑Pyr3和PLC阻斷劑U73122后,0T-或CCK-8s引起的MACC兒茶酚胺的分泌量與單獨(dú)用U73122后MACC兒茶酚胺的分泌量無明顯差異,表明TRPC3在活化膽囊收縮素受體或縮宮素受體后不參與除Gq-PLCβ通路外的兒茶酚胺分泌。與此不同的是,雖然U73122將Mch誘導(dǎo)MACC兒茶酚胺的分泌量降低了 50%,但是Pyr3和U73122的組合使用進(jìn)一步使Mch引起MACC的兒茶酚胺分泌量進(jìn)一步降低至約15%,這表明在嗜鉻細(xì)胞中乙酰膽堿受體介導(dǎo)的MACC的兒茶酚胺分泌也是基于激活TRPC3而產(chǎn)生的。同樣的,實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)β-arrestin-1-/-基因敲除小鼠的嗜鉻細(xì)胞,給予Mch引起兒茶酚胺分泌,與WT小鼠兒茶酚胺分泌量比較,在β-arrestin-1-/-敲除的MACC中顯著降低。在WT小鼠中,U73122的應(yīng)用雖降低了 Mch誘導(dǎo)的兒茶酚胺分泌量約40%,而在Mch誘導(dǎo)β-arrestin-1-/-敲除的MACC的兒茶酚胺分泌減少了近80%。因此,β-arestin-1-TRPC3途徑是介導(dǎo)原代嗜鉻細(xì)胞中Mch誘導(dǎo)的兒茶酚胺分泌的有效活性成分。討論:這項(xiàng)工作揭示了除了經(jīng)典的G蛋白-TRP通道軸,β-arrestin-1也可以介導(dǎo)急性生理過程,通過直接結(jié)合并由此激活TRPC3通道。尤其在GPCR信號(hào)和拘禁蛋白功能領(lǐng)域,AT1R-β-arrestin-1-TRPC3分泌模式是一種新的GPCR激活方式。綜合起來看,本研究有助于闡明GPCR是如何調(diào)節(jié)離子通道活動(dòng)的,并為臨床上治療心力衰竭指明了一個(gè)新的方向。對(duì)人類在某些生理和病理?xiàng)l件,闡明細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激產(chǎn)生的不同反應(yīng)也將產(chǎn)生廣泛的影響。結(jié)論:1.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體可引起MACC兒茶酚胺的量子化釋放。2.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體引起MACC兒茶酚胺的量子化釋放是由β-arrestin-1 介導(dǎo)的。3.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體引起MACC兒茶酚胺的量子化釋放主要通過細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流而實(shí)現(xiàn)。4.TRV120027激活TRPC3通道引起鈣內(nèi)流導(dǎo)致兒茶酚胺分泌。5.β-arrestin-1介導(dǎo)的AT1R與TRPC3的偶聯(lián)是一種新的GPCR激活的方式。目的:幾乎所有的生命活動(dòng)過程都受到Ca~(2+)的調(diào)控。Ca~(2+)作為胞內(nèi)第二信使,在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)包括分泌在內(nèi)的各種生理過程。鈣離子在調(diào)控分泌中的核心作用得到確立。在囊泡出胞的過程中,Ca~(2+)更是觸發(fā)最后融合的關(guān)鍵因子。據(jù)我們前述的研究結(jié)果,β-拘禁蛋白偏向性配體刺激小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞引起的兒茶酚胺釋放主要通過細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流而實(shí)現(xiàn)的,本實(shí)驗(yàn)研究鈣通道在β-拘禁蛋白偏向性配體引起的鈣離子變化中的作用。方法:本研究主要應(yīng)用鈣成像記錄法以明確證明AT1R拘禁蛋白介導(dǎo)的兒茶酚胺分泌胞內(nèi)鈣離子的變化及機(jī)制,并應(yīng)用小分子抑制劑、通道阻斷劑和β-arrestin-1、β-arrestin-2、TRPC3敲除小鼠的原代嗜鉻細(xì)胞內(nèi)鈣的變化加以證實(shí)。并用293細(xì)胞進(jìn)行AT1R,β-arrestin-1和TRPC3共表達(dá)實(shí)驗(yàn),以驗(yàn)證TRV120027作用于AT1R,β-arrestin-1和TRPC3在細(xì)胞膜上的共定位情況。結(jié)果:1.β 拘禁蛋白偏向性配體引起MACC內(nèi)的[Ca~(2+)]增加不能被U73122阻斷本研究中首先選用AT1R全激動(dòng)劑AngⅡ作用于嗜鉻細(xì)胞1min使F340/380比值升高,細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i升高,U73122阻斷后,再用AngⅡ后MACC的F340/380比值升高降低了約50%。在β-arrestin-2基因敲除的小鼠中得到了相同的結(jié)果。而且在β-arrestin-2-基因敲除小鼠的嗜鉻細(xì)胞,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027引起MACC的F340/380的比值仍然升高約0.4,進(jìn)一步說明β-arrestin-2不能介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]的升高變化。但是β-arrestin-2基因敲除比較WT小鼠嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)],的比值升高更明顯(p0.05)。而高KC1導(dǎo)致的β-arrestin-2 i基因敲除小鼠嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i升高,和WT小鼠嗜鉻細(xì)胞[Ca~(2+)]_i升高變化不明顯,說明β-arrestin-2敲除不影響高KC1對(duì)MACC的分泌效應(yīng),這與第一部分結(jié)果中對(duì)嗜鉻細(xì)胞分泌的影響一致。2.β-arrestin-1介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化本實(shí)驗(yàn)中首先用AT1R的全激動(dòng)劑AngⅡ作用于β-arrestin-1敲除的嗜鉻細(xì)胞后F340/380比值升高,細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i升高,用U73122 阻斷后,再用AngⅡ作用MACC后,嗜鉻細(xì)胞的F340/380比值未見升高,比較分析差異非常顯著(p0.005)。其次,選用AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027作用于β-arrestin-1-敲除的嗜鉻細(xì)胞1min后F340/380比值未發(fā)生變化,即嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i,未發(fā)生變化。由此得到結(jié)果,β-arrestin-1介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化。3.細(xì)胞外Ca~(2+)對(duì)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化的影響AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體SII和TRV120027 在無鈣溶液中作用于MACC后F340/380比值不變,沒有記錄到[Ca~(2+)]_i升高變化,與在標(biāo)準(zhǔn)鈣溶液中記錄到的F340/380比值升高比較分析差異非常顯著(p0.01)。高KC1作用于MACC后F340/380比值升高約1.5以上,使[Ca~(2+)]_i,升高,當(dāng)切換到無鈣離子的外液時(shí),也未出現(xiàn)F340/380比值的變化,胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i未升高,兩者分析比較差異極顯著(p0.005)。由此證實(shí),AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體作用于MACC后,使細(xì)胞外的Ca~(2+)內(nèi)流,致使細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i升高。4.TRP通道介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化實(shí)驗(yàn)中選擇不同鈣通道阻斷劑,L型鈣通道阻斷劑尼卡地平、R型鈣通道阻斷劑SNX482和電壓門控性鈣通道阻斷劑CdCl2,阻斷相應(yīng)通道后,用AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027作用于MACC,仍可記錄到F34/F380比值升高,通過分析比較各阻斷劑的抑制率沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異,證實(shí)尼卡地平、SNX482和CdCl2未阻斷鈣內(nèi)流。最后選擇非特異性TRP通道阻斷劑釘紅(Ruthenium Red,RR),阻斷TRP通道后,再給TRV120027作用于MACC,卻未出現(xiàn)F340/K380比值的升高,嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i未發(fā)生變化,說明RR明顯的抑制了TRV120027引起的鈣離子變化,鈣內(nèi)流被阻斷,即TRP通道介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化。5.TRPC3介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化實(shí)驗(yàn)中選擇不同TRP通道阻斷劑,檢測(cè)AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配體TRV120027作用于MACC后胞內(nèi)[Ca2]i的變化,以確定哪種TRP通道起作用。當(dāng)用TRPV4特異性阻斷劑HC067047和TRPC4特異性阻斷劑ML-204阻斷相應(yīng)通道后,TRV120027作用于MACC,仍記錄到F340/F380比值升高,通過分析比較各阻斷劑的抑制率沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異,HC067047和ML-204未阻斷TRV120027引起的MACC的鈣內(nèi)流。選用非特異性TRPC3/6/7阻斷劑氧化鑭后,再給TRV120027作用于MACC,并未出現(xiàn)F340/F380比值的升高,說明氧化鑭明顯的抑制了TRV120027引起的鈣離子變化,鈣內(nèi)流被阻斷;應(yīng)用特異性TRPC3通道阻斷劑Pyr3后,TRV120027作用于MACC引起的鈣內(nèi)流也被阻斷。以上結(jié)果可知,TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i增加是由TRPC3通道介導(dǎo)的。6.TRPC3,β-arrestin-1和AT1R共表達(dá)把TRPC3-GFP和β-arrestin-1-RFP共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,100nM Ang Ⅱ和100nMTRV20007刺激后β-arrestin-1-RFP 上膜,Merge后與TRPC3共定位在細(xì)胞膜上。把TRPC3-GFP和AT1R-cherry共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,100nM Ang Ⅱ和100nM TRV120027刺激后AT1R受體上膜,Merge后與TRPC3共定位在細(xì)胞膜上。證實(shí)了TRV120027刺激AT1R-arrestin1后迅速偶聯(lián)激活TRPC3通道。討論:我們的結(jié)果表明,AT1R招募了β-arrestin-1到質(zhì)膜并以快速促進(jìn)形成的AT1R-arrestin-1-TRPC3復(fù)合物的方式,從而導(dǎo)致TRPC3通道的直接開放,介導(dǎo)細(xì)胞外Ca~(2+)流入并觸發(fā)兒茶酚胺分泌。本研究闡明了GPCR信號(hào)傳導(dǎo)和抑制功能的新范例。β-arrestin介導(dǎo)的AT1R與TRPC3的偶聯(lián)是一種新的GPCR激活的方式。結(jié)論:1.β-arrestin-1介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化。2.TRPC3介導(dǎo)TRV120027引起的嗜鉻細(xì)胞內(nèi)[Ca~(2+)]_i變化。3.β-arrestin-1介導(dǎo)的AT1R與TRPC3的偶聯(lián)是一種新的GPCR激活方式。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R363
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本文編號(hào)：1537420