本文關(guān)鍵詞： 艱難梭菌感染 單克隆抗體 轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域 突變毒素　出處：《華南理工大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種嚴(yán)格厭氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌,目前被認(rèn)為是引起抗生素相關(guān)腹瀉及假膜性結(jié)腸炎的主要致病菌。近十幾年來,由于抗生素的普及及濫用,以及高毒菌株027/NAP1/BI的出現(xiàn),使艱難梭菌感染(Clostridium difficile infections,CDIs)的發(fā)生率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢,同時也對現(xiàn)有的治療方法表現(xiàn)出了抗藥性。因此,對于CDIs的預(yù)防、控制、診斷、治療及對其致病機(jī)理的研究已經(jīng)引起了全世界的廣泛關(guān)注。C.difficile的致病因子主要是其分泌的兩種大分子蛋白毒素——毒素A(TcdA)及毒素B(TcdB),其中TcdB被認(rèn)為是CDIs感染中必需的因子。鑒于毒素在CDIs中的重要作用,目前對CDIs的致病機(jī)理研究主要集中在對毒素蛋白的結(jié)構(gòu)與功能及其分子作用兩方面的研究。而對于CDIs的診斷則主要通過檢測病人糞便中的毒素蛋白或基因來作出診斷。因此,本論文的工作主要包括兩部分:第一部分,探討TcdB轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能;第二部分,制備能用于CDIs診斷的抗TcdB單克隆抗體并應(yīng)用于實驗室診斷。TcdA及TcdB由四個結(jié)構(gòu)域組成,分別是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域及受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域占毒素蛋白全長的45%,但是目前人們對其的結(jié)構(gòu)與功能卻仍不太了解。有研究表明,在轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的C-端有一段由97個氨基酸組成的區(qū)域D97對TcdB的轉(zhuǎn)位起關(guān)鍵作用,因此,本課題通過GOR4、SIMPA96及Chou-Fasman(Prot Scal)3種蛋白二級結(jié)構(gòu)分析工具,對D97的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測,發(fā)現(xiàn)位于D97 N-端的AA1756-1780區(qū)域可能對毒素的傳遞有重要作用。通過分子克隆手段,成功構(gòu)建了毒素突變體TcdB_(Δ1756-1780)(刪除AA1756-1780區(qū)域),并在巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中對其進(jìn)行了表達(dá)并純化。對TcdB_(Δ1756-1780_的體內(nèi)外毒性進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)外毒性比TcdB_(fl)下降了約1×10~6倍,所以AA1756-1780對TcdB的毒性有重要作用。進(jìn)一步對AA1756-1780區(qū)域的功能進(jìn)行探討。用圓二色譜分析對比了全長毒素TcdB_(fl)與TcdB_(Δ1756-1780)的整體結(jié)構(gòu),并系統(tǒng)地檢測了TcdB_(Δ1756-1780)各個結(jié)構(gòu)域的功能,發(fā)現(xiàn)刪除AA1756-1780后,毒素的整體蛋白結(jié)構(gòu)并沒有明顯的改變,且保留了完整的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、半胱氨酸蛋白酶活性及受體結(jié)合功能,同時也能在體外成功完成酸性環(huán)境下蛋白構(gòu)象的改變及膜穿孔作用。然而,當(dāng)以CT26全細(xì)胞為底物時,TcdB_(Δ1756-1780)卻不能催化其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Rho GTP酶進(jìn)行葡萄糖基化。因此,我們對經(jīng)過毒素處理的CT26細(xì)胞的內(nèi)涵體進(jìn)行提取并通過Western blot進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)TcdB_(Δ1756-1780)進(jìn)入內(nèi)涵體后,并不能順利完成酶催化區(qū)的傳遞與釋放,而是被困于內(nèi)涵體內(nèi)并迅速降解。因此,我們推斷TcdB_(Δ1756-1780)并不能正確地完成酸性條件下的構(gòu)象改變,導(dǎo)致毒素的傳遞及酶催化區(qū)域的釋放過程受阻,從而被困于內(nèi)涵體中并降解。由于CDIs所引起的腹瀉等癥狀與其他病因引起的癥狀并沒有明顯的區(qū)別,因此實驗室診斷在CDIs的診斷中起著關(guān)鍵性的作用�，F(xiàn)在有多種實驗室診斷方法,毒素的酶聯(lián)免疫法(Toxin EIA)是其中最常用的方法,這種方法具有成本低、操作簡單及檢測時間短等優(yōu)點,但是其靈敏度不高,因而需要提高Toxin EIA中使用的抗體的靈敏度及特異性。本論文通過使用本課題組構(gòu)建的無毒的毒素突變體a TcdB作為抗原,免疫小鼠,取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,篩選得到效價較高的4株陽性雜交瘤細(xì)胞株,分別為A7、B9、D3及G2。對4株抗體進(jìn)行大量制備及純化后,分別使用間接ELISA及SPR的方法對其效價及親和力進(jìn)行了測定,A7、B9、D3及G2的效價分別為1×10~6、1×10~6、1×10~6及1×10~7,親和力常數(shù)分別為4.29×10~(-9)、1.01×10~(-7)、1.22×10~(-8)和1.84×10~(-11)。將得到的4株抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記后,在雙抗夾心ELISA平臺上進(jìn)行抗體配對,按照抗體對所能識別抗原最低濃度對抗體配對的強(qiáng)弱進(jìn)行評價,得到3對抗體對G2-A7、G2-B9及G2-D3。根據(jù)抗體在ELISA平臺的配對結(jié)果,對抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記,初步建立針對TcdB的G2-A7膠體金快速檢測平臺,并使用90個臨床糞便樣品(40個陽性樣品,50個陰性樣品)對膠體金快速檢測平臺進(jìn)行了初步的評價,其特異性及靈敏度分別為90%(95%CI:78.2%-96.7%)及92.5%(95%CI:79.6%-98.4%)。
[Abstract]:This paper studies the structure and function of TcdA and TcdB , and it has been used in laboratory diagnosis . The research shows that the pathogenesis of C . difficile is mainly focused on the structure and function of toxin protein and its molecular mechanism . In this paper , we concluded that TcdB _ ( 螖1756 - 1780 ) could not be used to carry out the transformation of protein conformation and membrane perforation in the acidic environment . The results showed that TcdB _ ( 螖1756 - 1780 ) could not be used to carry out the process of enzyme catalysis .

【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1530132