本文關(guān)鍵詞： 硫化氫 先兆子癇 調(diào)控性T細(xì)胞 Th17細(xì)胞 樹(shù)突狀細(xì)胞 脂氧素A4 DSS 急性腸炎 B1O細(xì)胞 CX3CR1 巨噬細(xì)胞 脂氧素A4 膿毒血癥 GM-CSF B細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 STAT5　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 硫化氫在低劑量LPS誘導(dǎo)的先兆子癇小鼠模型中的免疫調(diào)控機(jī)制研究目的：先兆子癇(PE)是妊娠過(guò)程中的一種涉及多系統(tǒng)的綜合癥。異常的母體免疫反應(yīng)和炎癥被涉及到先兆子癇的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。硫化氫(H2S)是一種內(nèi)源性的氣體遞質(zhì),具有抗炎和免疫調(diào)控特性。本課題旨在探討在LPS誘導(dǎo)的先兆子癇小鼠模型中H2S發(fā)揮抗炎及保護(hù)胎兒作用的免疫調(diào)控機(jī)制,從而為H2S臨床治療先兆子癇拓寬視野并奠定理論基礎(chǔ)。方法：采用低劑量LPS誘導(dǎo)小鼠先兆子癇,用ELISA法檢測(cè)小鼠血清TNF-α、 IL-6和IL-10的含量,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟及引流子宮的腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)的檢測(cè)不同組小鼠CD4+Toxp3+ Treg細(xì)胞、CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞、CD11c+ CD80+ DCs的比例,用real-time PCR法檢測(cè)小鼠脾臟CBS和CSE、脾臟和腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)Foxp3、Tet1及Tet2,小鼠腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)的表達(dá)。結(jié)果：1.LPS組小鼠血清TNF-a和IL-6含量明顯高于Control組,IL-10明顯低于Control組,胎鼠重量明顯低于Control組,而H2S供體NaHS治療后明顯改善了LPS的效應(yīng)：2.LPS組小鼠脾臟CSE表達(dá)明顯低于Control組,CBS的表達(dá)兩組之間無(wú)明顯差異;3.LPS組小鼠脾臟和腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)中CD4+ Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例及Foxp3、Tetl的表達(dá)均低于Control組,而LPS+NaHS組CD4+Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例及Foxp3、Tetl的表達(dá)均顯著高于LPS組;Tet2的表達(dá)在小鼠脾臟和腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)中的表達(dá)三組之間均無(wú)顯著性差異；4.LPS組小鼠脾臟和腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)中CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞的比例及IL-17A和RORyt的表達(dá)均高于Control組,而LPS+NaHS組CD4+L-17+ Th17細(xì)胞的比例在脾臟與LPS組無(wú)顯著性差異,在腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)明顯低于LPS組,IL-17A和RORyt的表達(dá)在腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)均顯著低于LPS組：5.小鼠脾臟CD11c+ CD80+ DCs的比例LPS組高于Control組和LPS+NaHS組。結(jié)論：1.H2S供體NaHS減輕低劑量LPS誘導(dǎo)先兆子癇模型中的系統(tǒng)性炎癥,并且緩解胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩；2.NaHS促進(jìn)Treg細(xì)胞擴(kuò)增,減少Th17細(xì)胞,維持DCs在不成熟狀態(tài),從而發(fā)揮保護(hù)作用;3.NaHS促進(jìn)Treg細(xì)胞增加與上調(diào)Tet1的表達(dá)相關(guān)。第二部分 脂氧素A4在DSS誘導(dǎo)的急性腸炎小鼠模型中的免疫調(diào)控機(jī)制研究目的：炎癥性腸病(IBD)是一類至今病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確的腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。目前認(rèn)為免疫異常在IBD的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。有報(bào)道一群分泌IL-10的調(diào)控B細(xì)胞(B10)可抑制DSS誘導(dǎo)的腸炎。另外有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在腸道炎癥過(guò)程中,從血單核細(xì)胞來(lái)源的CX3CR1+巨噬細(xì)胞進(jìn)入腸道后功能發(fā)生改變,從而破環(huán)了腸道穩(wěn)態(tài)。脂氧素A4(LXA4)是一種內(nèi)源性花生四烯酸的代謝產(chǎn)物,在炎癥中發(fā)揮著抗炎及促炎癥解決的作用。本研究通過(guò)建立DSS誘導(dǎo)的急性腸炎模型系統(tǒng)探討了LXA4保護(hù)腸炎過(guò)程中對(duì)B細(xì)胞及CX3CR1+巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用,為L(zhǎng)XA4治療IBD提供新的理論依據(jù)。方法：1.采用小鼠飲用3.5%DSS溶液連續(xù)7天建立DSS誘導(dǎo)的急性腸炎模型,同時(shí)每天給予腹腔注射LXA4 (10μg/kg)治療,記錄體重并進(jìn)行DAI評(píng)分及病理組織學(xué)分級(jí),用ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織LXA4及IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-γ的含量,用real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸組織5-LOX及IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ及iNOS mRNA的表達(dá)量。2.用磁珠分選法純化正常小鼠脾臟CD19+B細(xì)胞,用RT-PCR檢測(cè)脾臟及純化的CD19+B細(xì)胞上的ALX/FPR2。3.建立DSS誘導(dǎo)的急性腸炎模型的第1天開(kāi)始每天給予LXA4治療,取小鼠第3、5、7天的脾臟細(xì)胞用LPS (10μg/ml)、PMA(50ng/ml)、ionomycin (750ng/ml)和monensin (2μM)體外誘導(dǎo)5小時(shí),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B10細(xì)胞的比例：第8天用real-time PCR檢測(cè)脾臟純化的CD19+B細(xì)胞IL-10和GM-CSF mRNA表達(dá)量。4.脾臟切除術(shù)后小鼠飲用3.5%DSS溶液連續(xù)7天,同時(shí)每天給予腹腔注射LXA4 (10μg/kg)治療,進(jìn)行DAI評(píng)分,用real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸組織IL-6、TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達(dá)量。5.用FITC標(biāo)記葡聚糖檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。6.免疫組織化學(xué)檢測(cè)腸道固有層CD68+細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Ly6C+細(xì)胞、腸道固有層和腸系膜淋巴結(jié)中CX3CR1+細(xì)胞的比例及腸系膜淋巴結(jié)CD4+IFN-γ+T細(xì)胞和CD4+IL-17+T細(xì)胞比例,real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸固有層細(xì)胞的CCR7 mRNA表達(dá)量及腸系膜淋巴結(jié)IL-6、IFN-γ、IL-17的mRNA表達(dá)量。6.用Western blot分別檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB p65、ERK1/2、STAT3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。結(jié)果：1.DSS+LXA4組DAI評(píng)分和病理學(xué)分級(jí)明顯低于DSS組,結(jié)腸組織中IL-6、 TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量及IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ及iNOS mRNA表達(dá)水平均低于DSS組;DSS組結(jié)腸LXA4含量和5-LOX mRNA表達(dá)量均比Control組減少。2.脾臟純化的CD19+B細(xì)胞表達(dá)ALX/FPR2。3.在DSS誘導(dǎo)的急性腸炎第3、5、7天DSS組和DSS+LXA4組脾臟B10細(xì)胞比例均明顯低于Control組,DSS+LXA4組與DSS組無(wú)明顯差異。4.脾臟切除術(shù)后,LXA4依然能緩解腸道的急性炎癥。DSS+LXA4組DAI評(píng)分明顯低于DSS組,DSS+LXA4組結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達(dá)量明顯低于DSS組。5. DSS+LXA4組腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力低于DSS組,但是巨噬細(xì)胞的比例兩組間沒(méi)有明顯差異。6.LXA4抑制DSS誘導(dǎo)的急性腸炎中結(jié)腸固有層和腸系膜淋巴結(jié)的CX3CR1+細(xì)胞。外周血中Ly6C+細(xì)胞的比例DSS+LXA4組和DSS組無(wú)明顯差異,結(jié)腸固有層中表達(dá)CD68+的細(xì)胞DSS+LXA4組明顯少于DSS組,結(jié)腸固有層及腸系膜淋巴結(jié)中DSS+LXA4組CX3CR1+細(xì)胞比例明顯低于DSS組,腸系膜淋巴結(jié)IFN-γ+CD4+T細(xì)胞、IL-17+CD4+T細(xì)胞的比例DSS+LXA4組明顯低于DSS組；DSS+LXA4組結(jié)腸固有層細(xì)胞CCR7 mRNA表達(dá)量低于DSS組,腸系膜淋巴結(jié)IL-6、IFN-γ、IL-17的mRNA表達(dá)量DSS+LXA4組均明顯低于DSS組。7.結(jié)腸組織中NF-κB、ERK1/2和STAT3蛋白表達(dá)DSS+LXA4組與LXA4組沒(méi)有顯著性差異,但其磷酸化水平DSS+LXA4組明顯低于LXA4組。結(jié)論：1.LXA4緩解DSS誘導(dǎo)的急性腸炎,但是并不依賴于脾臟B細(xì)胞的調(diào)控。2.LXA4通過(guò)減少腸道固有層CX3CR1+細(xì)胞和抑制其向淋巴結(jié)的遷移而降低T細(xì)胞免疫應(yīng)答,從而發(fā)揮保護(hù)作用。3.LXA4通過(guò)抑制結(jié)腸組織的NF-κB、ERK1/2及STAT3蛋白磷酸化水平而發(fā)揮作用。第三部分 脂氧素A4在LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠模型中對(duì)B細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究目的：膿毒血癥是一種嚴(yán)重威脅生命的疾病,以重度炎癥、多器官功能衰竭和死亡為特征。近期報(bào)道一群分泌粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的B細(xì)胞,能夠在膿毒血癥中起重要保護(hù)作用。脂氧素A4 (LXA4)是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物,具有抗炎及促解決的特性。近年來(lái)已經(jīng)報(bào)道了LXs對(duì)多種免疫細(xì)胞具有調(diào)控作用,最近有報(bào)道LXA4能夠抑制人記憶B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生和增生。但是關(guān)于LXA4對(duì)分泌GM-CSF的B細(xì)胞亞群的調(diào)控作用目前還沒(méi)有報(bào)道。本研究通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠模型,探討LXA4對(duì)分泌GM-CSF的B細(xì)胞的調(diào)控作用,為L(zhǎng)XA4的免疫調(diào)控作用打開(kāi)新的視野。方法：1.采用腹腔注射LPS (10μg/只)連續(xù)四天建立LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥模型,同時(shí)每天給予腹腔注射LXA4 (10μg/kg)治療,第五天用ELISA法檢測(cè)小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-6、TNF-α和IL-1β的含量。2. real-time PCR檢測(cè)小鼠脾臟和純化的CD19+B細(xì)胞GM-CSF mRNA的表達(dá)量,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中GM-CSF+CD19+B細(xì)胞的比例及平均熒光強(qiáng)度(MFI)= 3. real-time PCR檢測(cè)脾臟純化CD19+B細(xì)胞的VLA-4和LFA-1的mRNA水平：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腹腔CD19+B的比例：將正常小鼠腹腔純化的CD19+B細(xì)胞用CFSE標(biāo)記,然后腹腔注射到小鼠體內(nèi),緊接著每天腹腔注射LPS (10μg/只)連續(xù)兩天,同時(shí)每天給予LXA4 (10μg/ml)治療,48小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟CFSE標(biāo)記CD19+B細(xì)胞的比例。4. real-time PCR檢測(cè)正常小鼠腹腔中純化的巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞上LXA4受體ALX/FPR2的表達(dá)量;用氯磷酸鹽脂質(zhì)體清除腹腔巨噬細(xì)胞后腹腔注射LPS(10μg/只)連續(xù)四天,同時(shí)每天給予LXA4 (10μg/kg)治療,第5天用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟GM-CSF+CD19+B細(xì)胞的比例。5.我們分離脾臟細(xì)胞和純化的CD19+B細(xì)胞,用Western blot分別檢測(cè)STAT5蛋白及其磷酸化水平。結(jié)果：1.LPS+LXA4組小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-6、TNF-α和1L-1β的含量明顯低于LPS組。2.LPS+LXA4組脾臟和純化的CD19+B細(xì)胞GM-CSF mRNA的表達(dá)量明顯高于LPS組：脾臟中GM-CSF+CD19+B細(xì)胞的比例LPS+LXA4組高于LPS組,平均熒光強(qiáng)度LPS+LXA4組和LPS組沒(méi)有顯著性差異。3.LPS+LXA4組脾臟純化CD19+B細(xì)胞中VLA-4和LFA-1的mRNA表達(dá)量顯著高于LPS組;CFSE標(biāo)記CD19+B細(xì)胞腹腔注射到小鼠體內(nèi)48小時(shí)后,LPS+LXA4組脾臟中CFSE標(biāo)記CD19+B細(xì)胞的比例明顯高于LPS組。4.腹腔巨噬細(xì)胞清除后LPS+LXA4組脾臟GM-CSF+CD19+B細(xì)胞的比例明顯高于LPS組。5.脾臟細(xì)胞及純化的CD19+B細(xì)胞中LPS+LXA4組STAT5蛋白磷酸化水平均明顯高于LPS組。結(jié)論：在LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠模型中LXA4通過(guò)促進(jìn)腹腔B細(xì)胞遷移到脾臟,促使脾臟中表達(dá)GM-CSF的B細(xì)胞增多,但不依賴于腹腔巨噬細(xì)胞,從而發(fā)揮保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過(guò)激活STAT5通路。
[Abstract]:The expression of TNF - 偽 , IL - 6 and IL - 10 in mouse spleen and abdominal aortic lymph nodes was significantly lower than that in control group . The expression of CD4 + Foxp3 + Treg cells and Foxp3 and Tetl in the spleen and abdominal aortic lymph nodes of LPS group were significantly lower than that in control group . Objective : To study the effects of anti - inflammatory and pro - inflammatory effects of LXA4 and IL - 6 , TNF - 偽 , IL - 1尾 , IFN - 緯 and iNOS mRNA in mice with acute enteritis induced by DSS . The levels of IL - 6 , TNF - 偽 , IL - 1尾 , IFN - 緯 and IL - 6 , TNF - 偽 , IL - 1尾 , IFN - 緯 and iNOS mRNA were significantly lower in DSS group than in control group . Objective : To study the effect of LXA4 on the regulation and control mechanism of B - cells in DSS + LXA4 group . Conclusion : 1 . LXA4 is a metabolic product of arachidonic acid and has no significant difference in the levels of IL - 6 銆，

本文編號(hào)：1512245