本文關(guān)鍵詞： bMSCs S-bMSC 衰老 不對(duì)稱(chēng)分裂 單細(xì)胞測(cè)序　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,b MSCs)由于其來(lái)源于自體,無(wú)致瘤性,免疫原性低等特點(diǎn)被應(yīng)用于多種疾病的臨床細(xì)胞治療試驗(yàn),但是在體外培養(yǎng)過(guò)程中,會(huì)發(fā)生復(fù)制性衰老現(xiàn)象,這種衰老不光伴隨著增殖能力進(jìn)行性的喪失,還伴有分化能力的丟失,已經(jīng)成為b MSCs臨床應(yīng)用領(lǐng)域最大的瓶頸之一。同時(shí),b MSCs又是一群異質(zhì)性的細(xì)胞群,在分裂過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)分裂現(xiàn)象,由此導(dǎo)致的不均一性和不可預(yù)知性也阻礙了優(yōu)化b MSCs潛能的研究。本研究一方面旨在通過(guò)對(duì)b MSCs群體的基因表達(dá)譜分析,找到發(fā)揮重要作用的衰老調(diào)控基因,另一方面則更希望通過(guò)對(duì)單個(gè)b MSC(S-b MSC)的培養(yǎng),建立b MSCs不對(duì)稱(chēng)分裂的研究模型,并利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)找到影響b MSCs不對(duì)稱(chēng)分裂,調(diào)控細(xì)胞衰老,鑒別b MSCs不同潛能的基因。第一部分:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老調(diào)控基因的研究方法:首先通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、Ed U增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控因子的檢測(cè)、β-Gal衰老實(shí)驗(yàn)、組蛋白H2A.X Ser139磷酸化水平的差異比較早晚代b MSCs增殖潛能的差異,確定晚代b MSCs的衰老表型。通過(guò)基因芯片檢測(cè)具有較強(qiáng)增殖潛能且不易衰老的MAPCs的基因表達(dá)譜,與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中b MSCs和ESCs的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)作比較,找出MAPCs中特異性表達(dá)的基因,利用半定量PCR法從這些基因中篩選出b MSCs自然傳代(衰老)過(guò)程中呈漸變趨勢(shì)的基因作為調(diào)控b MSCs衰老的候選基因DDR2。合成DDR2特異性的si RNA,轉(zhuǎn)染入b MSCs中,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),通過(guò)CCK8法和Ed U增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DDR2被抑制后b MSCs的增殖能力,利用β-Gal衰老實(shí)驗(yàn)、衰老標(biāo)志物p16、h TERT的檢測(cè)和DNA彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DDR2被抑制后b MSCs的衰老表型和DNA損傷情況。合成CARM1特異性的si RNA,轉(zhuǎn)染入b MSCs中,檢測(cè)DDR2、p16和h TERT的表達(dá)水平的變化,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),利用β-Gal衰老實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的衰老表型,通過(guò)過(guò)表達(dá)和補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)確定CARM1是否是DDR2的上游調(diào)控分子。通過(guò)外源性上調(diào)b MSCs中CARM1和DDR2的水平,觀察能否促進(jìn)b MSCs的增殖。利用CARM1的抑制劑和染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Ch IP)驗(yàn)證CARM1是否通過(guò)修飾DDR2啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3R17的甲基化影響DDR2的表達(dá)。結(jié)果:晚代b MSCs細(xì)胞生長(zhǎng)變緩,細(xì)胞形態(tài)變大偽足變長(zhǎng),無(wú)克隆生成,較早代b MSCs細(xì)胞增殖能力減弱,出現(xiàn)顯著的衰老表型和DNA損傷。利用基因表達(dá)譜差異分析找到一組MAPCs中特異性表達(dá)的基因,驗(yàn)證了這些基因在b MSCs自然傳代(衰老)過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì),找到候選基因DDR2,DDR2表達(dá)被抑制后細(xì)胞增殖能力減弱,出現(xiàn)較多的衰老細(xì)胞,H2A.X Ser139的磷酸化水平增高,DNA損傷加劇,p16水平上調(diào),h TERT水平下調(diào)。CARM1表達(dá)被抑制后,p16水平上調(diào),h TERT和DDR2的表達(dá)下調(diào),b MSCs細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型。過(guò)表達(dá)CARM1或DDR2并不能影響p16的水平,也不能促進(jìn)b MSCs增殖。過(guò)表達(dá)CARM1可以上調(diào)DDR2的水平,加入CARM1特異性甲基化修飾的抑制劑以后DDR2水平下調(diào),出現(xiàn)大量衰老細(xì)胞。CARM1在DDR2啟動(dòng)子區(qū)有富集,DDR2啟動(dòng)子區(qū)有H3R17的甲基化修飾,過(guò)表達(dá)和干擾CARM1均會(huì)影響H3R17的甲基化修飾的水平。結(jié)論:MAPCs具有特有的基因表達(dá)譜,晚代b MSCs細(xì)胞大量衰老,增殖能力顯著下降,DDR2在b MSCs衰老調(diào)控中起關(guān)鍵作用,CARM1通過(guò)上調(diào)DDR2調(diào)控b MSCs衰老。外源性表達(dá)CARM1和DDR2作用有限,可以通過(guò)研究單個(gè)b MSC(S-b MSC)找到調(diào)控b MSCs不對(duì)稱(chēng)分裂和衰老的基因。第二部分:單個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂模型的研究方法:將b MSCs從骨髓原代分離純化后傳代培養(yǎng)至P3代,利用活細(xì)胞示蹤劑(CFSE)標(biāo)記細(xì)胞,后將標(biāo)記后的b MSCs細(xì)胞群消化成S-b MSC,通過(guò)貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的方式研究b MSCs的不對(duì)稱(chēng)分裂。通過(guò)將標(biāo)記后的S-b MSC按比例與未標(biāo)記的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(u MSCs)懸浮共培養(yǎng),研究b MSC的不對(duì)稱(chēng)分裂。將未標(biāo)記的S-b MSC單獨(dú)懸浮培養(yǎng),研究b MSC的不對(duì)稱(chēng)分裂。將上述三種方式培養(yǎng)的S-b MSC分裂后的單個(gè)子細(xì)胞消化分離并裂解保存,以備后續(xù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、建庫(kù)、測(cè)序。結(jié)果:CFSE標(biāo)記后的S-b MSC單獨(dú)培養(yǎng)不會(huì)分裂,在與u MSCs共同培養(yǎng)后可出現(xiàn)分裂,并形成細(xì)胞團(tuán),但不適合后續(xù)研究。無(wú)標(biāo)記的S-b MSC單獨(dú)懸浮培養(yǎng)條件下除了2,4,8分裂相,還可出現(xiàn)3、5、6、7等非對(duì)數(shù)分裂相,對(duì)2、3、4細(xì)胞期各子細(xì)胞成功分離并保存。結(jié)論:S-b MSC在懸浮培養(yǎng)條件下可出現(xiàn)多種細(xì)胞期,研究同一細(xì)胞期之間的子細(xì)胞的基因表達(dá)差異為研究b MSCs不對(duì)稱(chēng)分裂提供了一個(gè)模型,研究不同細(xì)胞期之間的子細(xì)胞基因表達(dá)差異為研究b MSCs的增殖與衰老提供了一個(gè)模型。第三部分:單個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增建庫(kù)及表面標(biāo)志物表達(dá)差異分析方法:將從2、3、4細(xì)胞期采集到的單個(gè)子細(xì)胞裂解,并利用3’末端poly A加尾法逆轉(zhuǎn)錄子細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的m RNA,通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增和純化獲得各期子細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組c DNA。通過(guò)q PCR檢測(cè)子細(xì)胞c DNA中b MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)水平,確定子細(xì)胞的身份,比較這些表面標(biāo)志物的表達(dá)差異,分析各期子細(xì)胞的異質(zhì)性和潛能。將子細(xì)胞c DNA交予公司建庫(kù)以備后續(xù)高通量測(cè)序分析。結(jié)果:成功擴(kuò)增各細(xì)胞期子細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組,各細(xì)胞期子細(xì)胞均表達(dá)陽(yáng)性標(biāo)志物CD90分子,均未表達(dá)陰性標(biāo)志物分子,陽(yáng)性標(biāo)志物CD105分子在同一細(xì)胞期的子細(xì)胞之間有差異表達(dá)。陽(yáng)性標(biāo)志物CD73分子在4細(xì)胞期子細(xì)胞之間有差異表達(dá)。擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄組c DNA達(dá)到建庫(kù)要求,成功建庫(kù)。結(jié)論:S-b MSC在分裂初期即出現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)分裂現(xiàn)象,并會(huì)在之后的分裂中持續(xù)存在。b MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)在S-b MSC分裂模型中呈現(xiàn)時(shí)空特異性的動(dòng)態(tài)變化。后續(xù)對(duì)子細(xì)胞的高通量測(cè)序?qū)⒔沂靖嘣诓粚?duì)稱(chēng)分裂和衰老過(guò)程中扮演重要作用的基因。
[Abstract]:Bone marrow - derived mesenchymal stem cells ( b MSCs ) have been used in clinical cell therapy of various diseases due to their origin , no genicity , low immunogenicity and so on . The expression level of DDR2 , p16 and h was detected by means of gene expression profiling . The expression of DDR2 , p16 and h was decreased , and the expression of DDR2 , p16 and h was decreased . In this paper , we studied the asymmetric division of b MSCs from 2 , 3 , 4 cell stages . The positive marker CD105 has a differential expression between the sub - cells of the same cell period . The positive marker CD73 has a differential expression between the 4 - cell sub - cells . Conclusion : The S - b MSC has asymmetric division during the initial division , and it will continue to exist in the later division . The expression of the surface marker of the MSCs can be dynamically changed in the S - b MSC division model . The high - throughput sequencing of the subsequent pairs will reveal more genes which play an important role in the process of asymmetric division and senescence .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 María álvarez-Viejo;Yolanda Menéndez-Menéndez;Jesús Otero-Hernández;;CD271 as a marker to identify mesenchymal stem cells from diverse sources before culture[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

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本文編號(hào)：1508310