本文關(guān)鍵詞： 乙型肝炎病毒 APOBEC3B 逆轉(zhuǎn)錄 脫氨基作用　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:HBV病毒是一種嗜肝DNA病毒,以逆轉(zhuǎn)錄方式進(jìn)行復(fù)制。APOBEC3B是一種天然免疫分子,具有清除外源病毒或內(nèi)源轉(zhuǎn)座子的能力,在宿主的防御過程中起著重要的作用。最近研究報(bào)道表明APOBEC3B能對(duì)HBV ccc DNA進(jìn)行脫氨基作用,氨基化的ccc DNA通過UNG家族蛋白所介導(dǎo)的BER修復(fù)途徑降解。由于APOBEC3B是細(xì)胞內(nèi)的穿梭蛋白,除了在核內(nèi)作用于ccc DNA外,APOBEC3B能否在HBV復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)發(fā)揮抑制作用尚不清楚。因此,本文重點(diǎn)研究了宿主限制性因子APOBC3B在逆轉(zhuǎn)錄過程中抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制,其研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明APOBC3B抑制HBV的分子機(jī)制,并以此為靶點(diǎn)篩選新的抗病毒藥物。方法:(1)APOBEC3B抑制HBV復(fù)制的表型和功能研究:利用HBV轉(zhuǎn)染-復(fù)制系統(tǒng),在Hep G2.0細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染外源表達(dá)APOBEC3B和HBV A、B、C、D四種不同基因型表達(dá)質(zhì)粒,Southern blot檢測(cè)了APOBEC3B對(duì)四種HBV四種基因型的抑制作用;研究了APOBEC3B對(duì)HBV基因型D相關(guān)復(fù)制參數(shù)的檢測(cè):ELISA檢測(cè)了細(xì)胞上清中HBs Ag表達(dá)水平,q PCR檢測(cè)了HBV核心顆粒DNA和ccc DNA的表達(dá)水平;應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了APOBEC3B羧基端脫氨酶活性位點(diǎn)H253R突變體,ELISA檢測(cè)了細(xì)胞上清中HBs Ag的恢復(fù)情況、q PCR檢測(cè)了Core DNA的水平變化,Southern blot驗(yàn)證了APOBEC3B羧基端的抗病毒作用,3D PCR和克隆測(cè)序研究了APOBEC3B對(duì)HBV病毒顆粒DNA發(fā)生的脫氨基作用;根據(jù)APOBEC3B羧基端的三維結(jié)構(gòu),構(gòu)建了羧基端活性中心附近的三個(gè)螺旋區(qū)段(α2,α3,α4)的缺失突變體和α4螺旋區(qū)內(nèi)(D316A,K320A,E321A,R327A,D328A)位點(diǎn)的突變體,Southern blot篩選了參與APOBEC3B抑制HBV復(fù)制的重要區(qū)段和關(guān)鍵位點(diǎn),3D PCR和克隆測(cè)序進(jìn)行了驗(yàn)證。進(jìn)一步研究了APOBEC3B對(duì)病毒在逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)形成的復(fù)制中間體(包括病毒DNA和RNA)的脫氨基作用進(jìn)行分析:Southern blot驗(yàn)證了HBV聚合酶突變體YMHA和RNAse H酶突變體D702A突變體構(gòu)建成功,3D-PCR和克隆測(cè)序研究了APOBEC3B對(duì)HBV逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制環(huán)節(jié)中的病毒顆粒負(fù)鏈DNA、正鏈DNA和pg RNA發(fā)生的脫氨基作用。(2)APOBEC3B在逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)與病毒蛋白相互作用抑制HBV復(fù)制的機(jī)制研究:首先免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)了APOBEC3B的細(xì)胞內(nèi)定位,超速離心提取HBV病毒顆粒檢測(cè)了APOBEC3B在細(xì)胞漿中病毒顆粒內(nèi)的表達(dá),提取細(xì)胞核漿蛋白分析了APOBEC3B的核漿分布;然后分析了APOBEC3B與病毒蛋白的相互作用:免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)了APOBEC3B與HBV Core蛋白和P蛋白的相互作用,并用RNase A處理分析這種作用是否依賴于RNA,根據(jù)APOBEC3B的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了APOBEC3B的五個(gè)區(qū)段缺失突變體(△10-65AA、△66-100AA、△124-194AA、△253-284AA、△289-373AA),免疫共沉淀檢測(cè)了APOBEC3B與P蛋白的結(jié)合區(qū)段,Southern blot檢測(cè)了此區(qū)段的抗病毒作用。結(jié)果:(1)APOBEC3B抑制HBV復(fù)制的表型和功能研究:Hep G2.0細(xì)胞中過表達(dá)外源的APOBC3B明顯對(duì)細(xì)胞無毒性;APOBEC3B能夠顯著抑制HBV A、B、C、D四種HBV基因型的復(fù)制;APOBEC3B顯著抑制HBV基因型D上清中HBs Ag、病毒顆粒DNA和ccc DNA表達(dá)水平;APOBEC3B羧基端脫氨酶活性位點(diǎn)H253位點(diǎn)突變后,喪失了對(duì)病毒DNA的抑制作用,表明APOBC3B依賴于脫氨酶方式抑制病毒復(fù)制,同時(shí)H253位點(diǎn)是APOBEC3B重要的脫氨酶活性和抗病毒活性位點(diǎn),進(jìn)一步通過3D PCR和克隆測(cè)序表明APOBEC3B對(duì)HBV核心顆粒中的DNA誘導(dǎo)了大量的G-A突變,這種G-A突變主要以5’-Gp A-3’的二聯(lián)核苷酸的形式;最后通過Southern blot和3D-PCR篩選APOBEC3B羧基端脫氨酶活性中心的結(jié)構(gòu)域表明α3和α4螺旋區(qū)缺失后,其抗病毒活性消失,并且α4區(qū)域的D316位點(diǎn)突變后,APOBEC3B的脫氨酶活性和抗病毒活性消失;APOBEC3B對(duì)HBV負(fù)鏈DNA發(fā)生編輯作用,形成大量的G-A突變,對(duì)HBV正鏈DNA進(jìn)行編輯作用,形成少量的C-T突變,H253脫氨酶活性位點(diǎn)突變后,這種編輯形成的突變消失;APOBEC3B主要作用于HBV負(fù)鏈DNA的X區(qū)段,具有序列特異性;APOBCE3B對(duì)病毒pg RNA不發(fā)揮編輯作用。(2)APOBEC3B在逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)與病毒蛋白相互作用抑制HBV復(fù)制的機(jī)制研究:細(xì)胞組分定位分析表明APOBEC3B大部分分布于細(xì)胞核,少量分布于細(xì)胞質(zhì),核定位信號(hào)區(qū)突變后,APOBC3B位于細(xì)胞質(zhì)中,并通過依賴于脫氨酶方式抑制HBV復(fù)制;免疫共沉淀表明APOBEC3B與HBV核心蛋白Core發(fā)生相互結(jié)合作用,并且這種結(jié)合依賴RNA;APOBEC3B與HBV聚合酶P發(fā)生相互結(jié)合作用,且APOBEC3B蛋白氨基端的(124AA-194AA殘基)是APOBEC3B與HBV P蛋白發(fā)生相互作用的重要區(qū)段。結(jié)論:APOBEC3B是一種天然抗病毒免疫因子,能夠通過脫氨基作用抑制HBV復(fù)制;羧基端D316位點(diǎn)是APOBEC3B脫氨酶和抗病毒的關(guān)鍵位點(diǎn);APOBEC3B可以與HBV Core蛋白相互結(jié)合促進(jìn)APOBEC3B包裝進(jìn)入病毒顆粒,在HBV逆轉(zhuǎn)錄過程中結(jié)合pg RNA和HBV P蛋白,然后編輯病毒的負(fù)鏈DNA和正鏈DNA,發(fā)生脫氨基作用,促進(jìn)了HBV DNA的降解。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373.21

【參考文獻(xiàn)】

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1 韓珠;于曉方;張文艷;;宿主抗病毒因子BST-2抑制HBV釋放的研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2016年02期

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本文編號(hào)：1489069