本文關(guān)鍵詞： 哺乳動物細(xì)胞抗體庫 計算機輔助分子設(shè)計 PD-1 FV78　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：抗體藥物是現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的主力軍,其臨床應(yīng)用從最初的抗移植排斥逐步拓展至腫瘤、自身免疫疾病、抗感染、心腦血管疾病、眼科用藥以及生物安全防控等重大領(lǐng)域。治療性抗體的發(fā)展經(jīng)歷了多克隆抗血清、鼠源單克隆抗體、人源化抗體以及全人抗體四個階段。人源化以及全人抗體是抗體藥物發(fā)展的主流和趨勢。在人-人雜交瘤技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠、抗體庫技術(shù)以及EB病毒轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞等全人抗體制備技術(shù)中,抗體庫技術(shù)是目前最為常用的技術(shù)之一。噬菌體抗體庫技術(shù)是目前抗體研發(fā)最廣泛使用的技術(shù)。阿達(dá)木單抗(修美樂)是該技術(shù)平臺下篩選獲批的首個全人源單抗藥物,并且連續(xù)幾年(2012-2015)蟬聯(lián)全球暢銷藥物排行榜之首。但是,與目前抗體藥物規(guī)�；a(chǎn)常用的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系相比,噬菌體使用的原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏精細(xì)的蛋白質(zhì)折疊和修飾過程,從中篩選獲得的抗體往往不能反映天然抗體的構(gòu)象和翻譯后修飾水平。因此,利用哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)展示天然構(gòu)象和翻譯后修飾的抗體具有實際的應(yīng)用價值和前景。但是,受制于轉(zhuǎn)染效率、培養(yǎng)體系等因素,哺乳動物細(xì)胞抗體庫往往庫容量較小(約106),限制了其廣泛應(yīng)用。計算機輔助分子設(shè)計是近年來抗體優(yōu)化篩選的一個新興技術(shù),利用計算機輔助分子設(shè)計針對特異性抗原表位設(shè)計人工抗體庫,能在一定程度上提高抗體庫中功能性抗體以及高親和力抗體的比例。因此,利用計算機輔助分子設(shè)計結(jié)合哺乳動物細(xì)胞展示系統(tǒng)有助于在有限的抗體庫容基礎(chǔ)上,優(yōu)化抗體庫質(zhì)量,提高抗體庫篩選效率。腫瘤免疫治療經(jīng)歷了漫長的探索和重大的挫折之后逐漸顯現(xiàn)出良好的治療效果并有望改變目前腫瘤的治療策略。針對CTLA-4、PD-1/PD-L1等“免疫卡控點分子”的單抗拮抗劑以及基于抗體結(jié)構(gòu)設(shè)計的新型CART技術(shù)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域突破性的療效奠定了抗體在該領(lǐng)域的重要地位。程序性死亡受體-1(PD-1)是一類重要的免疫負(fù)性調(diào)控分子(也稱“免疫卡控點分子”),主要在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá),通過與NK等細(xì)胞表面的PD-L1以及PD-L2配體結(jié)合,激活負(fù)調(diào)控信號,抑制免疫細(xì)胞的過度活化。大量的研究顯示,多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1分子,通過PD-1/pd-l1信號通路形成機體免疫耐受,逃避機體的免疫反應(yīng);特異性阻斷pd-1/pd-l1信號通路,可以有效激活免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞。因此,pd-1/pd-l1成為腫瘤免疫治療的熱門靶標(biāo)。國外制藥巨頭針對pd-1分子單抗藥物研發(fā)展開了激烈的競爭,其中bms公司研發(fā)的nivolumab抗體獲fda上市批準(zhǔn),應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤、鱗狀非小細(xì)胞肺癌、腎癌等多個腫瘤的臨床治療;除了單藥使用外,nivolumab與其他靶向藥物聯(lián)合使用的臨床試驗正在開展,并取得良好的進(jìn)展。但是,目前國內(nèi)只有兩家企業(yè)生產(chǎn)的pd-1抗體獲得臨床批文。因此,篩選具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型pd-1抗體具有重要的理論和實際意義。本論文構(gòu)建了哺乳動物細(xì)胞展示系統(tǒng),并以pd-1為靶點,借助計算機輔助分子設(shè)計設(shè)計獲得了靶向pd-1抗體庫,結(jié)合流式高通量篩選候選抗體;進(jìn)一步建立體內(nèi)外評價模型,合理評價候選抗體生物學(xué)活性。具體研究結(jié)果如下:1、哺乳動物細(xì)胞展示系統(tǒng)的構(gòu)建及驗證為了實現(xiàn)抗體在哺乳動物細(xì)胞表面展示、單一細(xì)胞表達(dá)單一抗體基因等抗體庫篩選的基本原則,我們在frt-flp-in?定點整合系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了抗體fab結(jié)構(gòu)域膜表達(dá)載體pfrt/kigg1fabhtm;同時構(gòu)建了全長抗體表達(dá)載體prt/kigg1,可實現(xiàn)與抗體庫中篩選獲得候選抗體進(jìn)行快速對接表達(dá)。流式細(xì)胞以及激光共聚焦等實驗顯示,pfrt/kigg1fabhtm載體能夠?qū)崿F(xiàn)fab抗體在哺乳動物細(xì)胞膜表面展示�？拱２├《究贵w、抗西尼羅河病毒抗體、抗pd-1抗體以及抗cd3抗體等多個抗體的瞬時表達(dá)結(jié)果結(jié)果顯示,各抗體在全長抗體表達(dá)載體prt/kigg1上的瞬時表達(dá)量可達(dá)100μg/ml;利用該系統(tǒng)構(gòu)建了抗pd-1抗體、抗cd3抗體等多個抗體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,規(guī)�；骷优囵B(yǎng)14天后抗體的表達(dá)量可達(dá)1.2g/l。提示,prt/kigg1載體是一套通用、高效的全長抗體表達(dá)載體。進(jìn)一步,我們利用紅、綠熒光蛋白驗證frt-flp-in?體系是否能實現(xiàn)單一細(xì)胞表達(dá)單一抗體基因。研究結(jié)果顯示,frt-flp-in?穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體系下,每個細(xì)胞均只表達(dá)一種熒光蛋白基因;表明frt-flp-in?定點整合系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)單個細(xì)胞表達(dá)單一目的基因。借助構(gòu)建的哺乳動物表面展示系統(tǒng),將抗pd-1陽性抗體mil75的fab結(jié)構(gòu)域展示在cho表面,流式分析結(jié)果顯示,pd-1-fitc與細(xì)胞的結(jié)合呈劑量依賴性,提示該展示系統(tǒng)可以借助facs實現(xiàn)高通量篩選。2、靶向pd-1抗體庫構(gòu)建及篩選利用分子模擬與對接搭建pd-1與pd-l1復(fù)合物空間結(jié)構(gòu),根據(jù)pd-l1與pd-1相互作用模式分析獲得pd-l1參與識別pd-1分子關(guān)鍵氨基酸殘基。進(jìn)一步選用nivolumab抗體輕、重鏈可變區(qū)歸屬亞組(igkv3-11*01、ighv3-33*01)所對應(yīng)的通用序列為模板進(jìn)行合成抗體庫的設(shè)計,在抗體模板可及性表面積較大的殘基位點上引入一些與pd-l1關(guān)鍵殘基理化性質(zhì)相近的氨基酸突變,獲得與pd-l1識別pd-1作用模式類似的靶向抗體庫。借助前期構(gòu)建的哺乳動物細(xì)胞展示平臺,構(gòu)建抗pd-1靶向抗體庫,轉(zhuǎn)化子計數(shù)和二代高通量測序結(jié)果顯示,抗體庫涵蓋了輕鏈及大部分重鏈理論序列(實測序列多樣性vs理論設(shè)計序列多樣性,輕鏈96/96;重鏈7321/8640)的多樣性。進(jìn)一步利用流式分選技術(shù)對構(gòu)建的細(xì)胞庫進(jìn)行3輪富集篩選,獲得陽性克隆并進(jìn)行測序獲得候選抗體序列。對候選抗體序列進(jìn)行序列比對分析,按照序列同源性以及主鏈碳原子均方根位移等參數(shù)將所測120個抗體序列分為10組,并從中篩選13個代表性序列。將13個代表性的抗體序列進(jìn)行全長抗體表達(dá),表達(dá)量結(jié)果提示13株抗體均具有較高表達(dá)水平(15.2μg/ml~74.5μg/ml)。其中fv63(59μg/ml)、fv78(74.5μg/ml)表達(dá)量明顯高于對照抗體mil75(28.7μg/ml)。特異性結(jié)合活性實驗進(jìn)一步篩選獲得5株親和力較好的抗體(1-4×10-10m)。借助生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及計算機輔助分子模擬技術(shù)對篩選獲得的一系列抗體進(jìn)行抗體空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能、識別pd-1分子空間表位等進(jìn)行理論評估,最終確定了兩株的功能活性較好的候選抗體fv74、fv78。初步結(jié)果顯示fv78表達(dá)量優(yōu)于上市抗體mil75。3、靶向pd-1新抗體fv78生物學(xué)活性評價進(jìn)一步對靶向pd-1新抗體fv78開展體內(nèi)、外功能評價。實驗結(jié)果顯示,fv78特異性識別人pd-1分子,并與cd28家族其它成員(cd28、ctla4、btla、icos)不交叉;競爭elisa實驗結(jié)果提示fv78能夠有效阻斷pd-1與pdl1或pdl2之間相互作用,半數(shù)效應(yīng)濃度均為9.9μg/ml。體外pbmc活化模型以及dc-cd4+t混合淋巴培養(yǎng)實驗?zāi)Ｐ椭?fv78抗體能夠有效激活t細(xì)胞釋放ifn-γ。利用人外周血pbmc回輸免疫缺陷型小鼠npg,構(gòu)建移植物抗宿主疾病模型(gvhd),合理評價抗PD-1抗體的免疫激活活性。結(jié)果顯示,給予FV78抗體可以有效激活免疫系統(tǒng),加重GVHD反應(yīng),加速小鼠死亡(MST,FV78 vs N.S=36 vs 41 days,P0.05);相對于陽性對照MIL75組,FV78抗體具有一定優(yōu)效性(MST,FV78 vs MIL75=36 vs 39days,P=0.08)。綜合體內(nèi)外實驗結(jié)果提示,靶向PD1新抗體FV78具有不弱于陽性抗體MIL75的體內(nèi)外生物學(xué)活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392.11

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本文編號：1488592