本文關(guān)鍵詞： 胸腺B細(xì)胞 調(diào)節(jié)性B細(xì)胞 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 T細(xì)胞分化 免疫穩(wěn)態(tài)　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:胸腺是機(jī)體重要的中樞免疫器官,是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場(chǎng)所。胸腺細(xì)胞經(jīng)過陽性選擇、陰性選擇逐漸分化為成熟的T細(xì)胞,并遷移到外周免疫器官發(fā)揮功能。胸腺為T細(xì)胞發(fā)育提供了一個(gè)復(fù)雜的微環(huán)境,該微環(huán)境由胸腺基質(zhì)細(xì)胞、可溶性分子以及細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成,有序調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育、成熟和遷移等。近年來有少數(shù)研究工作證明,人和鼠的胸腺中均存在著少量的B細(xì)胞,其比例占到整個(gè)胸腺中所有細(xì)胞的0.1-0.5%。正常胸腺中存在著不同發(fā)育階段的B細(xì)胞,初步資料顯示,胸腺中B細(xì)胞具有一定的生理功能,例如參與胸腺內(nèi)T細(xì)胞的分化發(fā)育過程。胸腺B細(xì)胞可定位于胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)的連接處,該區(qū)域被認(rèn)為是胸腺T細(xì)胞分化發(fā)育過程中陰性選擇的發(fā)生場(chǎng)所,由此研究人員認(rèn)為胸腺B細(xì)胞在T細(xì)胞的陰性選擇過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,然而胸腺B細(xì)胞如何參與T細(xì)胞的陰性選擇過程及影響T細(xì)胞分化、發(fā)育機(jī)制等仍不清楚。在病理狀態(tài)下,在胸腺內(nèi)可發(fā)生B細(xì)胞的浸潤和淋巴濾泡的形成等異常表現(xiàn),少量研究表明,胸腺B細(xì)胞的異�？赡芘c自身免疫病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián),但是胸腺B細(xì)胞在自身免疫病中的功能和作用機(jī)制等仍不清楚。要解答這些問題都有待于進(jìn)一步闡明胸腺中B細(xì)胞的表型、功能和起源等。因此,我們圍繞胸腺B細(xì)胞的亞群鑒定及胸腺B細(xì)胞亞群在免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答中的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探討。目的:探究生理及自身免疫病中胸腺B細(xì)胞亞群變化及其在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答中的作用及機(jī)制。方法:1.首先,為了驗(yàn)證胸腺中是否存在B細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞進(jìn)行胞膜染色,對(duì)B細(xì)胞所占比例和表型進(jìn)行分析、鑒定;2.為了鑒定胸腺中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及效應(yīng)性B細(xì)胞,我們分析了正常小鼠和自身免疫病系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠胸腺中B細(xì)胞;為了分析胸腺中是否存在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞,分離胸腺淋巴細(xì)胞,用LPS(10mg/ml)體外刺激后,收集細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行胞內(nèi)染色,分析IL-10的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上,通過胞膜染色對(duì)胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞表型作進(jìn)一步分析;為了分析自身免疫病中胸腺效應(yīng)B細(xì)胞,分離胸腺淋巴細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)分析了分泌抗體的漿細(xì)胞。3.為了進(jìn)一步檢測(cè)胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)內(nèi)IL-10表達(dá)水平,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)后,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-10 m RNA相對(duì)表達(dá)量;4.為了研究胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)體外功能,首先經(jīng)胞膜染色標(biāo)記后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo),并通過磁珠分選CD4+T細(xì)胞;一方面用CFSE標(biāo)記CD4+T細(xì)胞后分別與調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)體外共培養(yǎng)72h,流式檢測(cè)CD4+T細(xì)胞增殖抑制情況;另一方面,直接將CD4+T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)體外共培養(yǎng)72h,收集細(xì)胞,經(jīng)流式胞內(nèi)染色檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平;5.為了研究胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)體內(nèi)生理功能,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)后,經(jīng)尾靜脈回輸給CD19cre小鼠和狼瘡小鼠,取脾、淋巴結(jié)、胸腺等免疫器官和組織,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,調(diào)節(jié)性B細(xì)胞,CD4-CD8+T細(xì)胞和CD8-CD4+T細(xì)胞等水平變化;經(jīng)眼球取血,ELISA分析外周血清中自身抗體滴度;取腎臟,4%甲醛固定后蘇木精-伊紅染色分析腎臟病理改善狀況。6.為了探討狼瘡小鼠胸腺B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞分化的影響,胞膜染色標(biāo)記后流式分選胸腺B細(xì)胞,經(jīng)尾靜脈回輸給野生型小鼠,一周后處死小鼠,流式檢測(cè)ISP細(xì)胞,CD4-CD8+和CD8-CD4+T細(xì)胞等變化情況。7.為了研究m TOR缺失對(duì)胸腺B細(xì)胞和ISP細(xì)胞的影響,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)m TOR+/-小鼠胸腺B細(xì)胞、不成熟CD8+T細(xì)胞(ISP,表型為CD3lo/-CD4-CD8+)比例和數(shù)目的變化。結(jié)果:1.在小鼠胸腺中檢測(cè)到一定比例的B細(xì)胞,B細(xì)胞占胸腺細(xì)胞0.1%;經(jīng)Ficoll分離胸腺淋巴細(xì)胞后,B220+細(xì)胞比例提高到13.35%,CD19+細(xì)胞比例提高到4.7%,并對(duì)B細(xì)胞表型做了進(jìn)一步分析。在胸腺細(xì)胞中存在IL-10+B細(xì)胞和Ig G+B細(xì)胞。2.在正常小鼠胸腺中存在一群表達(dá)IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi);在IL-10-GFP報(bào)告基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)存在B220+CD5+GFP+B細(xì)胞和CD19+CD5+GFP+B細(xì)胞,進(jìn)一步證實(shí)了胸腺中存在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞。3.調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)可以顯著抑制CD4+T細(xì)胞增殖;其抑制T細(xì)胞的機(jī)制是通過表面CD5分子與CD4+T細(xì)胞表面CD72分子間的相互作用促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化。4.調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD19+CD5+)缺失的CD19cre小鼠中,胸腺CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少,CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞增加。胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+)經(jīng)尾靜脈回輸給CD19cre小鼠后,胸腺CD4+Foxp3+Tregs數(shù)目增加,CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞減少,而且脾和淋巴結(jié)中CD4+Foxp3+Tregs也升高。5.胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)經(jīng)尾靜脈回輸給狼瘡樣小鼠,可有效地誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Tregs和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)的產(chǎn)生,從而降低外周血清中自身抗體滴度,改善腎臟病理,抑制狼瘡小鼠自身免疫反應(yīng)。6.在自身免疫病條件下,例如狼瘡樣小鼠胸腺中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)減少。同時(shí),胸腺整體B細(xì)胞異常升高,而且主要轉(zhuǎn)變?yōu)镮g G+B細(xì)胞。7.狼瘡樣小鼠胸腺中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)減少和漿細(xì)胞(表型為Ig G+)的增加可造成胸腺CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞增加。當(dāng)胸腺漿細(xì)胞缺失時(shí),CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞減少。8.對(duì)胸腺B細(xì)胞調(diào)控T細(xì)胞分化的作用機(jī)制進(jìn)行探討時(shí)發(fā)現(xiàn),胸腺B細(xì)胞升高可以促進(jìn)不成熟CD8+T(Immature single positive,ISP)細(xì)胞(表型為CD3lo/-CD4-CD8+)分化,進(jìn)而促進(jìn)CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞的分化。進(jìn)一步的研究顯示,m TOR信號(hào)參與調(diào)節(jié)ISP細(xì)胞的分化、發(fā)育。結(jié)論:小鼠胸腺中存在少量B細(xì)胞,在正常生理?xiàng)l件下,胸腺B細(xì)胞存在一群大量表達(dá)IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi),它可通過細(xì)胞間的直接接觸(CD5-CD72介導(dǎo)信號(hào))誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生來維持胸腺T細(xì)胞分化、發(fā)育穩(wěn)態(tài)。在自身免疫等病理?xiàng)l件下,如狼瘡樣小鼠疾病模型中發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞異常升高,胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhiIL-10+B)減少,漿細(xì)胞(表型為Ig G+)增加。漿細(xì)胞通過分泌Ig G促進(jìn)不成熟CD8+T(Immature single positive,ISP)細(xì)胞(表型為CD3lo/-CD4-CD8+)分化,進(jìn)而促進(jìn)CD4+CD8-和CD4-CD8+T細(xì)胞分化。我們的研究結(jié)果表明,胸腺B細(xì)胞通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育、分化參與免疫調(diào)節(jié)與免疫應(yīng)答。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1450873