本文關鍵詞： 胸腺B細胞 調節(jié)性B細胞 調節(jié)性T細胞 T細胞分化 免疫穩(wěn)態(tài)　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:胸腺是機體重要的中樞免疫器官,是T細胞分化、發(fā)育、成熟的場所。胸腺細胞經過陽性選擇、陰性選擇逐漸分化為成熟的T細胞,并遷移到外周免疫器官發(fā)揮功能。胸腺為T細胞發(fā)育提供了一個復雜的微環(huán)境,該微環(huán)境由胸腺基質細胞、可溶性分子以及細胞外基質共同構成,有序調控T細胞的發(fā)育、成熟和遷移等。近年來有少數(shù)研究工作證明,人和鼠的胸腺中均存在著少量的B細胞,其比例占到整個胸腺中所有細胞的0.1-0.5%。正常胸腺中存在著不同發(fā)育階段的B細胞,初步資料顯示,胸腺中B細胞具有一定的生理功能,例如參與胸腺內T細胞的分化發(fā)育過程。胸腺B細胞可定位于胸腺皮質和髓質的連接處,該區(qū)域被認為是胸腺T細胞分化發(fā)育過程中陰性選擇的發(fā)生場所,由此研究人員認為胸腺B細胞在T細胞的陰性選擇過程中發(fā)揮關鍵作用,然而胸腺B細胞如何參與T細胞的陰性選擇過程及影響T細胞分化、發(fā)育機制等仍不清楚。在病理狀態(tài)下,在胸腺內可發(fā)生B細胞的浸潤和淋巴濾泡的形成等異常表現(xiàn),少量研究表明,胸腺B細胞的異�？赡芘c自身免疫病的發(fā)生發(fā)展相關聯(lián),但是胸腺B細胞在自身免疫病中的功能和作用機制等仍不清楚。要解答這些問題都有待于進一步闡明胸腺中B細胞的表型、功能和起源等。因此,我們圍繞胸腺B細胞的亞群鑒定及胸腺B細胞亞群在免疫調節(jié)和應答中的作用及機制進行了初步探討。目的:探究生理及自身免疫病中胸腺B細胞亞群變化及其在機體免疫調節(jié)和應答中的作用及機制。方法:1.首先,為了驗證胸腺中是否存在B細胞,應用流式細胞術對小鼠胸腺淋巴細胞進行胞膜染色,對B細胞所占比例和表型進行分析、鑒定;2.為了鑒定胸腺中調節(jié)性B細胞及效應性B細胞,我們分析了正常小鼠和自身免疫病系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠胸腺中B細胞;為了分析胸腺中是否存在調節(jié)性B細胞,分離胸腺淋巴細胞,用LPS(10mg/ml)體外刺激后,收集細胞,通過流式細胞術進行胞內染色,分析IL-10的表達水平。在此基礎上,通過胞膜染色對胸腺調節(jié)性B細胞表型作進一步分析;為了分析自身免疫病中胸腺效應B細胞,分離胸腺淋巴細胞,通過流式細胞術分析了分泌抗體的漿細胞。3.為了進一步檢測胸腺調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)內IL-10表達水平,應用流式細胞儀分選調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)后,通過實時熒光定量PCR檢測IL-10 m RNA相對表達量;4.為了研究胸腺調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)體外功能,首先經胞膜染色標記后,應用流式細胞儀分選調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo),并通過磁珠分選CD4+T細胞;一方面用CFSE標記CD4+T細胞后分別與調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)體外共培養(yǎng)72h,流式檢測CD4+T細胞增殖抑制情況;另一方面,直接將CD4+T細胞與調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)體外共培養(yǎng)72h,收集細胞,經流式胞內染色檢測調節(jié)性T細胞水平;5.為了研究胸腺調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)體內生理功能,應用流式細胞儀分選調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)和非調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)后,經尾靜脈回輸給CD19cre小鼠和狼瘡小鼠,取脾、淋巴結、胸腺等免疫器官和組織,應用流式細胞術檢測調節(jié)性T細胞,調節(jié)性B細胞,CD4-CD8+T細胞和CD8-CD4+T細胞等水平變化;經眼球取血,ELISA分析外周血清中自身抗體滴度;取腎臟,4%甲醛固定后蘇木精-伊紅染色分析腎臟病理改善狀況。6.為了探討狼瘡小鼠胸腺B細胞對T細胞分化的影響,胞膜染色標記后流式分選胸腺B細胞,經尾靜脈回輸給野生型小鼠,一周后處死小鼠,流式檢測ISP細胞,CD4-CD8+和CD8-CD4+T細胞等變化情況。7.為了研究m TOR缺失對胸腺B細胞和ISP細胞的影響,應用流式細胞術檢測m TOR+/-小鼠胸腺B細胞、不成熟CD8+T細胞(ISP,表型為CD3lo/-CD4-CD8+)比例和數(shù)目的變化。結果:1.在小鼠胸腺中檢測到一定比例的B細胞,B細胞占胸腺細胞0.1%;經Ficoll分離胸腺淋巴細胞后,B220+細胞比例提高到13.35%,CD19+細胞比例提高到4.7%,并對B細胞表型做了進一步分析。在胸腺細胞中存在IL-10+B細胞和Ig G+B細胞。2.在正常小鼠胸腺中存在一群表達IL-10的調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi);在IL-10-GFP報告基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)存在B220+CD5+GFP+B細胞和CD19+CD5+GFP+B細胞,進一步證實了胸腺中存在調節(jié)性B細胞。3.調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)可以顯著抑制CD4+T細胞增殖;其抑制T細胞的機制是通過表面CD5分子與CD4+T細胞表面CD72分子間的相互作用促進CD4+T細胞向CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞轉化。4.調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD19+CD5+)缺失的CD19cre小鼠中,胸腺CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞減少,CD4+CD8-T細胞和CD4-CD8+T細胞增加。胸腺調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+)經尾靜脈回輸給CD19cre小鼠后,胸腺CD4+Foxp3+Tregs數(shù)目增加,CD4+CD8-T細胞和CD4-CD8+T細胞減少,而且脾和淋巴結中CD4+Foxp3+Tregs也升高。5.胸腺調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)經尾靜脈回輸給狼瘡樣小鼠,可有效地誘導CD4+Foxp3+Tregs和調節(jié)性B細胞(Bregs)的產生,從而降低外周血清中自身抗體滴度,改善腎臟病理,抑制狼瘡小鼠自身免疫反應。6.在自身免疫病條件下,例如狼瘡樣小鼠胸腺中調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)減少。同時,胸腺整體B細胞異常升高,而且主要轉變?yōu)镮g G+B細胞。7.狼瘡樣小鼠胸腺中調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)減少和漿細胞(表型為Ig G+)的增加可造成胸腺CD4+CD8-T細胞和CD4-CD8+T細胞增加。當胸腺漿細胞缺失時,CD4+CD8-T細胞和CD4-CD8+T細胞減少。8.對胸腺B細胞調控T細胞分化的作用機制進行探討時發(fā)現(xiàn),胸腺B細胞升高可以促進不成熟CD8+T(Immature single positive,ISP)細胞(表型為CD3lo/-CD4-CD8+)分化,進而促進CD4+CD8-T細胞和CD4-CD8+T細胞的分化。進一步的研究顯示,m TOR信號參與調節(jié)ISP細胞的分化、發(fā)育。結論:小鼠胸腺中存在少量B細胞,在正常生理條件下,胸腺B細胞存在一群大量表達IL-10的調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi),它可通過細胞間的直接接觸(CD5-CD72介導信號)誘導調節(jié)性T細胞的產生來維持胸腺T細胞分化、發(fā)育穩(wěn)態(tài)。在自身免疫等病理條件下,如狼瘡樣小鼠疾病模型中發(fā)現(xiàn)胸腺B細胞異常升高,胸腺調節(jié)性B細胞(表型為CD19+CD5+CD1dhiIL-10+B)減少,漿細胞(表型為Ig G+)增加。漿細胞通過分泌Ig G促進不成熟CD8+T(Immature single positive,ISP)細胞(表型為CD3lo/-CD4-CD8+)分化,進而促進CD4+CD8-和CD4-CD8+T細胞分化。我們的研究結果表明,胸腺B細胞通過調節(jié)T細胞發(fā)育、分化參與免疫調節(jié)與免疫應答。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：1450873