本文關(guān)鍵詞： 破傷風(fēng) 破傷風(fēng)毒素 單鏈抗體 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 細(xì)菌噬菌體　出處：《軍事醫(yī)學(xué)》2013年02期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的構(gòu)建人破傷風(fēng)免疫噬菌體單鏈抗體庫(kù),篩選抗破傷風(fēng)毒素重鏈C端(TeNT-Hc)的特異性單鏈抗體(scFv)。方法利用RT-PCR從5名破傷風(fēng)抗體滴度較高的健康獻(xiàn)漿員外周血淋巴細(xì)胞中獲得全套人破傷風(fēng)抗體VH和VL基因,經(jīng)過(guò)重疊PCR將VH和VL基因連接獲得scFv片段。將scFv片段克隆至pCANTAB5E載體,電轉(zhuǎn)化大腸TG1感受態(tài)菌,獲得抗體庫(kù)。以TeNT-Hc為抗原對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行3輪篩選,獲得特異性人源性抗TeNT-Hc單鏈抗體。scFv由pET32a(+)表達(dá)載體表達(dá),產(chǎn)物包涵體采用HisTrap FF預(yù)裝柱純化并透析復(fù)性。采用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)法測(cè)定scFv親和常數(shù)(affinity constant,KD值)。檢測(cè)scFv抑制TeNT-Hc與神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b結(jié)合的體外中和活性,計(jì)算抑制率。結(jié)果構(gòu)建庫(kù)容量為1×108的人破傷風(fēng)免疫噬菌體單鏈抗體庫(kù),經(jīng)過(guò)篩選獲得3株特異性較好的人源性抗TeNT-Hc單鏈抗體。原核表達(dá)結(jié)果顯示,3株scFv均以包涵體形式存在,表達(dá)量占菌體總蛋白的40%～45%。包涵體經(jīng)洗滌、純化和復(fù)性后,scFv均保持了與TeNT-Hc的特異結(jié)合活性,1 L培養(yǎng)物經(jīng)純化后可獲得4～6 mg scFv蛋白。親和力測(cè)定結(jié)果,27G、22D和S-4-7H-scFv的KD值分別為(1.25×10-7),(2.31×10-7)和(1.97×10-7)mol/L。3株抗體對(duì)TeNT-Hc與神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b結(jié)合的抑制率分別為64.5%,58.6%和51.5%。結(jié)論人破傷風(fēng)免疫噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及具有體外中和活性的特異性抗TeNT-Hc單鏈抗體的獲得,為人破傷風(fēng)基因工程中和抗體的制備奠定了良好基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct human tetanus immunized phage scFv library. Screening of specific scFv antibody against tetanus toxin heavy chain TeNT-Hc). Methods A complete set of human tetanus antibody VH and VL genes were obtained from peripheral blood lymphocytes of 5 healthy donors with high tetanus antibody titer by RT-PCR. The VH and VL genes were ligated by overlapping PCR to obtain the scFv fragment. The scFv fragment was cloned into pCANTAB5E vector and electrotransformed into Escherichia coli TG1 receptive bacteria. The antibody library was obtained. Using TeNT-Hc as antigen, the antibody library was screened for 3 rounds, and the specific human anti TeNT-Hc single chain antibody. ScFv was expressed by pET32a () expression vector. The inclusion bodies were purified by HisTrap FF preloading column and renatured by dialysis. The affinity constant of scFv was determined by non-competitive enzyme immunoassay. The neutralization activity of scFv on the binding of TeNT-Hc to ganglioside GT1b in vitro was detected. Results 1 脳 108 human tetanus immunized phage scFv library was constructed. After screening, three human anti TeNT-Hc scFv with good specificity were obtained. The prokaryotic expression results showed that all of the scFv strains were in the form of inclusion bodies. The specific binding activity of inclusion bodies to TeNT-Hc was maintained after washing, purification and renaturation. 1L culture was purified and 4mg scFv protein was obtained. The result of affinity test was 27G. The KD values of 22D and S-4-7H-scFv were 1.25 脳 10 ~ (-7). The inhibition rate of TeNT-Hc binding to ganglioside GT1b was 64.5%, respectively. Conclusion the construction of human tetanus immunized phage scFv library and the acquisition of specific anti TeNT-Hc scFv with neutralizing activity in vitro. The preparation of neutralizing antibody against human tetanus gene has laid a good foundation.
【作者單位】： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所疫苗與抗體工程研究室全軍生物武器損傷防治藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;解放軍第302醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心全軍感染病臨床實(shí)驗(yàn)診斷中心;解放軍第302醫(yī)院感染性疾病研究與診療中心;
【基金】：國(guó)家杰出青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81025018) 國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81102360,81172980)
【分類號(hào)】：R392
【正文快照】： 破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)外毒素引起的一種急性危重疾病。該致病菌在自然界中廣泛存在,其產(chǎn)生的破傷風(fēng)痙攣毒素毒性非常強(qiáng)烈,僅次于肉毒毒素[1]。世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全世界每年約有100萬(wàn)人感染發(fā)病,在一些國(guó)家人感染破傷風(fēng)后的死亡率仍可高達(dá)80%。聯(lián)合國(guó)兒童基金會(huì)公

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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