本文關(guān)鍵詞：伯氏瘧原蟲重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白的初步研究　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：重度瘧疾目前仍是撒哈拉以南非洲主要的致死疾病之一,其中腦型瘧疾最為兇險(xiǎn),因?yàn)槠浒l(fā)病初期的臨床表現(xiàn)和其他腦病很難區(qū)分,而一旦發(fā)病又會(huì)很快致死。腦型瘧疾的發(fā)生機(jī)制尚不清楚,也缺乏有效的治療。伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei ANKA,Pb)感染C57BL/6小鼠可以表現(xiàn)出類似人類腦型瘧疾的癥狀,但是發(fā)病率并不穩(wěn)定。前期研究顯示小鼠腦型瘧疾的發(fā)病率受到感染劑量的影響,因此我們通過分別注射103和106瘧原蟲感染的紅細(xì)胞來接種C57BL/6小鼠,并比較腦型瘧疾的發(fā)病率。結(jié)果顯示,低劑量感染組小鼠全部發(fā)生血腦屏障的破壞,即腦型瘧疾,而高劑量感染組只有約30%的小鼠出現(xiàn)該現(xiàn)象。低劑量感染組小鼠的蟲血率不超過10%,并于四天后出現(xiàn)活動(dòng)減少、木僵、偏癱和抽搐等癥狀;而高劑量感染組蟲血率明顯高于低劑量組,且只有小部分小鼠出現(xiàn)腦型瘧疾癥狀。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)低劑量感染組小鼠出現(xiàn)腦組織的出血和水腫,與其臨床癥狀一致。這些數(shù)據(jù)證明通過低劑量含蟲紅細(xì)胞感染小鼠可以有效建立腦型瘧疾的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。在此基礎(chǔ)上,我們又進(jìn)行了血常規(guī)和生理代謝方面的檢測(cè),結(jié)果顯示低劑量感染組小鼠的白細(xì)胞和血小板數(shù)量比高劑量組和未感染組有明顯下降,但是單核細(xì)胞比例上升、血糖下降且血脂升高。對(duì)免疫相關(guān)細(xì)胞的流式檢測(cè)顯示,雖然高、低劑量感染組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但和未感染組相比,樹突狀細(xì)胞的數(shù)量和比例降低,單核細(xì)胞的數(shù)量和比例上升,T淋巴細(xì)胞的活化增加。單細(xì)胞寄生蟲通常利用分泌蛋白來致病。引發(fā)瘧疾的瘧原蟲在進(jìn)入哺乳動(dòng)物血液后,會(huì)大幅重構(gòu)自身表面,并改造被感染的紅細(xì)胞表面的蛋白組分。因此,擾亂瘧原蟲蛋白分泌的手段將成為研究瘧原蟲致病性和免疫特性的關(guān)鍵。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白分泌的關(guān)鍵細(xì)胞器。我們的前期研究揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白YOP1介導(dǎo)管狀結(jié)構(gòu)的形成,而SEY1介導(dǎo)形成網(wǎng)絡(luò)所需的膜融合,這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白的突變導(dǎo)致細(xì)胞不同程度的生長(zhǎng)和分泌缺陷。我們通過基因的同源序列比對(duì),確定了伯氏瘧原蟲存在YOP1和SEY1的同源蛋白,體外脂質(zhì)體重組實(shí)驗(yàn)和蔗糖密度梯度實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證了PbYOP1具有誘導(dǎo)膜高曲度形成的功能和寡聚化趨勢(shì)。酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了PbYOP1和PbSEY1具有維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管狀網(wǎng)絡(luò)形態(tài)的功能。為了深入研究PbYOP1和PbSEY1在瘧原蟲發(fā)育和侵染過程中的生理功能,我們通過瘧原蟲轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了PbYOP1或PbSEY1缺失的重組瘧原蟲。我們的研究結(jié)果確立了小鼠腦型瘧疾的模型,為區(qū)分腦型瘧疾和非腦型瘧疾奠定了重要的基礎(chǔ),并找到了一些可用于早期診斷的線索。而伯氏瘧原蟲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白重組子的構(gòu)建,為后期利用蛋白組學(xué)分析誘發(fā)腦型瘧疾的關(guān)鍵分泌蛋白提供了重要工具,最終將用于闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)與功能在瘧原蟲生長(zhǎng)發(fā)育、侵染、和免疫隔離等過程中的作用機(jī)制。
[Abstract]:Severe malaria in sub Saharan Africa is still one of the leading killers, including cerebral malaria is the most dangerous, because the clinical manifestations of early onset of encephalopathy and other difficult to distinguish, but once the disease will soon die. The mechanism of cerebral malaria is not clear, the lack of effective treatment of Plasmodium berghei. (Plasmodium berghei ANKA, Pb) infected C57BL/6 mice can exhibit similar to human cerebral malaria symptoms, but the incidence is not stable. Previous studies have shown that the pathogenesis of mouse cerebral malaria infection rate is affected by the dose, so we were injected through 103 and 106 infection of Plasmodium red blood cells inoculated into C57BL/6 mice and compared the brain the incidence of malaria infection. The results showed that low dose group mice all occurred in the BBB, namely cerebral malaria, and high dose infection group, only about 30% of the mice appeared the phenomenon The low dose group of mice infected. Parasitemia does not exceed 10%, and reduced activity in four days, stupor, hemiplegia and convulsions and other symptoms; while high dose infection group parasitemia was significantly higher than the low dose group, and only a small part of mouse cerebral malaria symptoms. Histopathological examination found low dose infection mice had cerebral hemorrhage and edema, consistent with the clinical symptoms. These data proved that the experimental model by low dose containing insect can effectively establish cerebral malaria infected red blood cells in mice. On this basis, we also examined the blood and physiological metabolism, the results showed that low doses of white blood cells and infected mice the number of platelets in high dose group and non infection group decreased significantly, but the proportion of monocytes increased, elevated blood glucose and blood lipid. Decreased flow cytometry on immune cells, although high, low dose of infection There was no statistically significant difference between groups, but compared with the uninfected group, the number and proportion of dendritic cells decreased, the number and proportion of mononuclear cells increased, increased activation of T lymphocytes. Single cell secretory protein to pathogenic parasites usually use. Malaria causing Plasmodium in mammals into the blood, a reconstruction of the surface. Protein group and surface modification of infected red blood cells. Therefore, disrupting the Plasmodium protein secretion will become a key means of malaria parasite pathogenic and immunological characteristics. The endoplasmic reticulum is a critical organelle protein secretion. Our previous study reveals endoplasmic reticulum protein YOP1 mediates the formation of tubular structure, and SEY1 mediated formation the network required for membrane fusion, the endoplasmic reticulum shaping protein mutations lead to different degrees of cell growth and secretion by homologous sequence alignment. We determined the gene. The homologous protein of Plasmodium berghei YOP1 and SEY1 in vitro, liposome reconstitution experiments and sucrose density gradient experiments verified that the PbYOP1 has the function of inducing membrane and high curvature of the poly trend. Yeast and mammalian cells morphology of endoplasmic reticulum covering experiments further confirmed that PbYOP1 and PbSEY1 can maintain the tubular network morphology of endoplasmic reticulum function. In order to study the physiological function of PbYOP1 and PbSEY1 in the process of development of parasites and infection, we constructed recombinant Plasmodium PbYOP1 or PbSEY1 deletion by Plasmodium transfection experiments. The results of our study established a mouse model of cerebral malaria, laid an important foundation for the distinction between cerebral malaria and cerebral malaria, and found some can be used for early diagnosis of clues. And the construction of Plasmodium berghei recombinant protein of the endoplasmic reticulum remodeling, for further use of proteomic analysis by The key secretory proteins of cerebral malaria provide an important tool, which will eventually be used to elucidate the mechanism of endoplasmic reticulum morphology and function in the process of malaria growth, development, infection and immune isolation.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R382

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本文編號(hào)：1426595