本文關(guān)鍵詞：TLRs信號通路和Treg在H.pylori逃避宿主免疫清除和疫苗免疫保護(hù)中的作用　出處：《南昌大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景和目的:目前在對H.pylori與機(jī)體免疫反應(yīng)關(guān)系及H.pylori疫苗機(jī)制的研究多集中在獲得性特異性免疫反應(yīng),對固有免疫反應(yīng)在從中所起的作用很少研究,而只有同時研究H.pylori感染和疫苗所誘導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)才能真正闡明H.pylori免疫致病和疫苗免疫保護(hù)的機(jī)制。Toll樣受體(Tol1 1ike receptors,TLRs)是一類與固有免疫密切相關(guān),識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)的膜蛋白分子。TLRs信號通路可通過不同機(jī)制參與病原體的免疫致病和疫苗的免疫保護(hù)作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T-Cells,Treg)是具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體,其具有免疫抑制作用。CD4+CD25+Treg是Treg中最為重要的亞型,是免疫抑制機(jī)制中的關(guān)鍵成分。TLRs信號通路與Treg可相互影響,TLRs信號通路可抵抗Treg引起的免疫抑制,還可通過My D88依賴途徑調(diào)節(jié)Treg的功能。反之,Treg也可降低TLRs刺激的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。TLRs與Treg相互作用與影響,共同維持著機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡。但在H.pylori感染和H.pylori疫苗免疫時TLRs信號通路與Treg之間的相互作用與影響,及它們與H.pylori逃避宿主免疫清除和疫苗免疫保護(hù)作用的關(guān)系目前尚不清楚。為此,本文研究了H.pylori感染和不同佐劑的H.pylori疫苗接種后小鼠胃腸道局部TLRs信號通路和Treg的變化及其相互關(guān)系。從這一新的角度探討H.pylori逃避宿主免疫清除和H.pylori疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制。方法:1、H.pylori全菌蛋白抗原殼聚糖微球的制備及體外釋放特性研究采用Berthold沉淀法制備殼聚糖微球,并根據(jù)不同的殼聚糖、不同的沉淀劑、不同冰乙酸濃度、不同p H值和是否進(jìn)行超聲處理來優(yōu)化殼聚糖微球制備條件;使用掃描電鏡及粒徑分析儀觀察殼聚糖微球的形態(tài)及粒徑分布;以不同量比的微球與抗原,進(jìn)行殼聚糖微球包裹H.pylori全菌蛋白抗原;采用BCA蛋白定量法測量分析微球的抗原包裹率、包裹量及釋放率。2、TLRs信號通路和Treg在H.pylori感染和疫苗免疫保護(hù)中的作用的研究(1)TLRs信號通路和Treg在疫苗免疫保護(hù)中的作用的研究:6~8周齡的SPF級BALB/C小鼠隨機(jī)分為以下9組:(1)空白對照組:PBS溶液;(2)TLR4單抗+空白對照組;(3)CD25單抗+空白對照組;(4)H.pylori抗原+CT;(5)TLR4單抗+H.pylori抗原+CT;(6)CD25單抗+H.pylori抗原+CT;(7)殼聚糖微球-H.pylori抗原;(8)TLR4單抗+殼聚糖微球-H.pylori抗原;(9)CD25單抗+殼聚糖微球-H.pylori抗原;各組于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,免疫后4周后4組小鼠給予1×109活菌/ml的SS1 H.pylori菌液0.5ml/只進(jìn)行攻擊,隔日一次,共4次。末次攻擊后4周,處死小鼠,取標(biāo)本待測。(2)TLRs信號通路和Treg在H.pylori感染中的作用的研究:6~8周齡的SPF級BALB/C小鼠隨機(jī)分為以下3組:(1)直接建立H.pylori感染模型;(2)TLR4單抗預(yù)處理后建立H.pylori感染模型;(3)CD25單抗預(yù)處理后建立H.pylori感染模型。模型的建立:給予含109/ml的SS1 H.pylori菌液,0.5ml/只灌胃,隔日1次,共5次。末次灌胃12周后,處死小鼠,取標(biāo)本待測。(3)各項指標(biāo)檢測:(1)胃黏膜內(nèi)H.pylori的檢測:采用改良Giemsa染色檢測;(2)胃黏膜炎癥程度檢測:采用HE染色,并按Sakagami法評分;(3)胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3蛋白檢測:采用免疫組織化學(xué)染色法及Western blot檢測;(4)胃黏膜內(nèi)細(xì)胞因子IFN、IL-12、IL-17、IL-4、IL-10含量的檢測:采用雙抗體夾心ELISA法;(5)血清抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a及唾液中抗H.pylori Ig A含量的檢測:采用間接ELISA法檢測。結(jié)果:1、H.pylori全菌蛋白抗原殼聚糖微球的制備及體外釋放特性研究從32種殼聚糖微球制備方案中篩選出了以海得貝殼聚糖為原料、冰乙酸的濃度為1%、硫酸鈉為沉淀劑、p H值為5.0、不進(jìn)行超聲處理的最佳制備方案;經(jīng)掃描電鏡(SEM)示微球光滑圓整、致密,粒徑分布在1.0-5.0μm;抗原與微球的量比為1:5時包裹率最大,包裹時間為3h時包裹率可達(dá)最大,抗原包裹率為79.92%,包裹量為16.47%;體外釋放實驗表明,總抗原釋放率為20.39%,呈緩慢釋放狀態(tài)。2、TLRs信號通路和Treg在H.pylori感染和疫苗免疫保護(hù)中的作用的研究(1)兩種佐劑的H.pylori疫苗組TLR4阻斷小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),未予TLR4阻斷的疫苗組的定植密度顯著低于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠的H.pylori定植密度無差別(P0.05)。(2)H.pylori活菌接種后胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),未予TLR4阻斷的感染組的定植密度顯著低于TLR4阻斷的感染組(P0.05)。(3)兩種佐劑的H.pylori疫苗組未予CD25阻斷的H.pylori定植密度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),CD25阻斷的疫苗組的定植密度顯著低于未予CD25阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠的H.pylori定植密度無差別(P0.05)。(4)H.pylori活菌接種后胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),CD25阻斷的感染組H.pylori定植密度顯著低于未予CD25阻斷的感染組(P0.05)。(5)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃粘膜炎癥程度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜炎癥程度顯著低于未予TLR4阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠的胃粘膜炎癥程度無差別(P0.05)。(6)H.pylori活菌接種后胃黏膜的炎癥程度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),TLR4阻斷的感染組胃黏膜的炎癥程度顯著低于未予TLR4阻斷的感染組(P0.05)。(7)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜炎癥程度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),CD25阻斷的疫苗組胃黏膜的炎癥程度顯著高于未予CD25阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜炎癥程度無差別(P0.05)。(8)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜炎癥程度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),CD25阻斷的感染組胃黏膜的炎癥程度顯著高于未予CD25阻斷的感染組(P0.05)。(9)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達(dá)顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01-0.001),未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達(dá)顯著高于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05),免疫組化法測得未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達(dá)顯著低于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05),Western blot測得未予TLR4阻斷的疫苗組與TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達(dá)無明顯差異(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達(dá)無差別(P0.05)。(10)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達(dá)顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),未予TLR4阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達(dá)顯著高于TLR4阻斷的感染組(P0.05),未予TLR4阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達(dá)顯著低于TLR4阻斷的感染組(P0.05)。(11)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達(dá)顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),未予CD25阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達(dá)顯著低于CD25阻斷的疫苗組(P0.05),未予CD25阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達(dá)顯著高于CD25阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達(dá)無差別(P0.05)。(12)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達(dá)顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01-0.001),未予CD25阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達(dá)顯著低于CD25阻斷的感染組(P0.05),未予CD25阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達(dá)顯著高于CD25阻斷的感染組(P0.05)。(13)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),以CT為佐劑組無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-10含量顯著低于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),以殼聚糖微球為佐劑組無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-4含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)IL-10含量顯著高于未阻斷的空白對照組(P0.05),與TLR4阻斷的空白對照組無明顯差別(P0.05),未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)IL-10含量與TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組無明顯差別(P0.05)。未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05),未予TLR4阻斷的疫苗組與TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-10含量無明顯差異(P0.05)。TLR4阻斷以殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)IFN、IL-12、IL-17含量無差異(P0.05),TLR4阻斷以CT為佐劑組胃黏膜內(nèi)IFN含量顯著高于以殼聚糖微球為佐劑組(P0.05),IL-12、IL-17含量無差異(P0.05)。(14)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-10含量顯著低于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01)。未予TLR4阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷的感染組(P0.05-0.001),TLR4阻斷與未阻斷組胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-10含量無明顯差異(P0.05)。(15)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),以CT為佐劑組無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子含量顯著低于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),以殼聚糖微球為佐劑組無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-4含量顯著低于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),而胃黏膜內(nèi)IL-10含量無明顯差異(P0.05)。未予CD25阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)IFN、IL-17含量顯著低于CD25阻斷的疫苗組(P0.05),以殼聚糖微球為佐劑組未予CD25阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-12含量顯著低于CD25阻斷的(P0.05),而以CT為佐劑組中兩者胃黏膜內(nèi)IL-12含量無明顯差別(P0.05)。疫苗組CD25阻斷與未阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-4含量無明顯差異(P0.05),未阻斷的疫苗組的胃黏膜內(nèi)IL-10含量顯著高于CD25阻斷的疫苗組(P0.05-0.01)。CD25阻斷以CT和殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)IL-12、IL-17含量無差異(P0.05),CD25阻斷以CT為佐劑組胃黏膜內(nèi)IFN含量顯著高于以殼聚糖微球為佐劑組(P0.05)。CD25阻斷以殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子含量顯著高于以CT為佐劑組(P0.05)。(16)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子含量顯著低于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01-0.001)。未予CD25阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子含量顯著低于CD25阻斷的感染組(P0.05-0.001),未阻斷感染組胃黏膜內(nèi)IL-10含量顯著高于阻斷感染組(P0.05),而兩者胃黏膜內(nèi)IL-4含量無明顯差異(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細(xì)胞因子含量無差別(P0.05)。以殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)TH2細(xì)胞因子含量顯著高于以CT為佐劑組(P0.05)。(17)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),TLR4阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無明顯差異(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無差別(P0.05)。(18)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或未阻斷的血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),感染組TLR4阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無明顯差異(P0.05)。(19)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),疫苗組CD25阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G含量無明顯差異(P0.05),CD25阻斷疫苗組Ig G1、Ig G2a含量顯著高于未阻斷疫苗組(P0.05-0.001)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無差別(P0.05)。(20)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),感染組CD25阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1含量無明顯差異(P0.05),CD25阻斷感染組Ig G2a含量顯著高于未阻斷感染組(P0.05)。(21)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),TLR4阻斷疫苗組唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著高于未阻斷疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠抗H.pylori Ig A含量無差別(P0.05)。(22)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),TLR4阻斷感染組唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著低于未阻斷感染組(P0.05)。(23)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),以CT為佐劑疫苗組CD25阻斷的唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著高于未阻斷疫苗組(P0.01),以殼聚糖微球為佐劑疫苗組CD25阻斷的唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著低于未阻斷疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠抗H.pylori Ig A含量無差別(P0.05)。(24)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01),CD25阻斷感染組唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著低于未阻斷感染組(P0.05)。結(jié)論:1、本研究篩選的殼聚糖微球制備條件所制備的殼聚糖微球?qū).pylori全菌蛋白抗原具有較高的包裹率和較好的控釋效果。2、TLR4阻斷可降低H.pylori疫苗的免疫保護(hù)率,增加H.pylori自然感染小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度;而CD25阻斷可增加H.pylori疫苗的免疫保護(hù)率,降低H.pylori自然感染小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度。3、TLR4阻斷可減輕H.pylori疫苗接種小鼠和H.pylori感染小鼠胃黏膜炎癥程度;而CD25阻斷可加劇H.pylori疫苗接種小鼠和H.pylori感染小鼠胃黏膜炎癥程度。4、TLR4阻斷可下調(diào)My D88的表達(dá)和抑制NF-κB活化,增加CD4+CD25+Foxp3+Treg的數(shù)量,CD25阻斷可上調(diào)My D88的表達(dá)和促進(jìn)NF-κB活化,降低CD4+CD25+Foxp3+Treg的數(shù)量,這可能是它增強(qiáng)H.pylori疫苗的免疫保護(hù)作用、降低H.pylori自然感染小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度的機(jī)制。5、TLR4阻斷可降低TH1及TH17細(xì)胞因子水平,但對TH2細(xì)胞因子無影響,CD25阻斷可增加TH1及TH17細(xì)胞因子水平,降低TH2細(xì)胞因子。6、TLR4及CD25阻斷對血清中抗H.pylori Ig G無影響,CD25阻斷可增加血清中抗H.pylori Ig G1、Ig G2a水平。7、TLR4阻斷可增加唾液中抗H.pylori Ig A含量水平,CD25阻斷可降低唾液中抗H.pylori Ig A含量水平。8、以殼聚糖微球為佐劑的H.pylori疫苗與傳統(tǒng)的佐劑CT為佐劑的H.pylori疫苗對H.pylori感染具有同樣的免疫保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
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本文編號：1424865