本文關(guān)鍵詞：硫化氫陰性沙門菌遺傳變異規(guī)律及硫化氫參與沙門菌耐藥機制的研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：沙門菌是一種引起食源性腹瀉的常見病原菌,可通過食物、水源進行傳播,引發(fā)人類急性腹瀉甚至死亡。通常,絕大多數(shù)沙門菌可以產(chǎn)生硫化氫(hydrogen sulfide,H_2S),因此,H_2S是實驗人員初篩與鑒定沙門菌的重要生化指標(biāo)。近幾年H_2S陰性沙門菌在世界范圍內(nèi)不斷涌現(xiàn),尤其在我國,H_2S陰性沙門菌的流行更為普遍。沙門菌中,phs操縱子編碼硫代硫酸鹽還原酶,由phsA、phsB、phsC三段基因組成,是沙門菌產(chǎn)生H_2S的重要功能基因。研究指出,絕大部分的H_2S陰性沙門菌phsA基因發(fā)生了不同類型的突變,可能導(dǎo)致了沙門菌H_2S表型的缺失。此外,多重耐藥(multi-drug resistance,MDR)沙門菌在全球多地涌現(xiàn)。值得注意的是,H_2S陰性沙門菌的耐藥菌株也多次被研究人員檢出。由此可見,沙門菌耐藥問題日趨嚴重。已有研究指出,H_2S不僅是細菌硫代謝的副產(chǎn)物,還在細菌耐藥過程中發(fā)揮重要作用。目前,已在大腸桿菌、沙門菌等多種細菌中證實了這一重要的生物學(xué)功能。這不僅表明氣體分子作為一種新的耐藥方式被人們所認知,而且還揭示了細菌耐藥機制的復(fù)雜性。然而,H_2S作為新的耐藥方式調(diào)控細菌耐藥的分子機理卻不得而知�；谌珖抽T菌監(jiān)測平臺,本實驗室于2006至2013年間共收集到的90株H_2S陰性沙門菌。本研究旨在通過對H_2S陰性沙門菌遺傳變異規(guī)律的研究,揭示陰性菌與陽性菌之間的親緣關(guān)系,為我國沙門菌防控策略的制訂提供數(shù)據(jù)參考和科學(xué)依據(jù);同時,探究H_2S參與調(diào)控沙門菌耐藥背后可能的分子機制,為耐藥菌的治療提供新的靶點和思路,也為多重耐藥沙門菌的治療和防控提供依據(jù)。本研究通過細菌抗生素敏感實驗,分析90株H_2S陰性沙門菌自身的耐藥特點、各血清型的耐藥差異以及其與H_2S陽性沙門菌在耐藥表型上的不同,重點關(guān)注耐喹諾酮類藥物的沙門菌及多重耐藥菌株,為治療沙門菌感染時合理選擇抗生素提供重要科學(xué)依據(jù)。對21種抗生素敏感實驗的結(jié)果表明,H_2S陰性沙門菌對氨芐西林、替卡西林、慶大霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素及氯霉素的耐藥率高于H_2S陽性沙門菌。而對于頭孢類藥物、亞胺硫霉素、阿米卡星和氨曲南,H_2S陰性與陽性沙門菌均表現(xiàn)出普遍的敏感性。90株H_2S陰性沙門菌中,有13株對喹諾酮類藥物耐藥或者中介耐藥,檢測發(fā)現(xiàn)這些菌株gyr A或par C基因上有關(guān)鍵位點突變。另外,相同血清型的H_2S陰陽菌株對同種類的抗生素耐藥情況存在差異,包括豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌。值得注意的是,在分離的14種不同血清型的H_2S陰性沙門菌中,豬霍亂沙門菌不僅耐藥率最高,而且有76%的菌株為MDR菌株。脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)與多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)是研究細菌遺傳與親緣關(guān)系的常用方法。我們通過MLST分析將90株H_2S陰性沙門菌分為22種ST型別,其中包括兩種新的ST型:ST1960和ST1961。H_2S陰性雞沙門菌形成兩個克隆群(clonal complex),CC92與CC1960,而其他血清型的H_2S陰性沙門菌分別形成一個CC。山夫登堡、豬霍亂、乙型副傷寒沙門菌的H_2S陰陽菌株分別屬于不同的ST型。相比于H_2S陽性菌,陰性的腸炎、鼠傷寒沙門菌的ST型種類更多,而其它血清型的H_2S陰陽性菌株的ST型別相同。通過PFGE分析,47株H_2S陰性沙門菌與40株H_2S陽性沙門菌按照50%的相似度分為三個聚類組,其中腸炎、乙型副傷寒沙門菌H_2S陰陽性菌分別聚類在不同的聚類組中,說明H_2S陰性腸炎、乙型副傷寒沙門菌已經(jīng)形成了不同于陽性菌的進化分支。鼠傷寒、德比、阿貢納、湯伯遜和火雞沙門菌的H_2S陰陽性菌株分別聚類在同一聚類組里,說明這些血清型的H_2S陰陽性菌株親緣關(guān)系密切。分離于上海的H_2S陰性雞沙門菌與分離于廣州H_2S陰性腸炎沙門菌ST型相同、PFGE帶型相似,另外分離于玉溪與上海的H_2S陰性甲型副傷寒沙門菌具有相同的ST型和PFGE帶型,說明H_2S陰性沙門菌存在跨地區(qū)傳播的可能。此外,分離于家畜的H_2S陰性德比、鼠傷寒沙門菌與同血清型的人源陽性菌PFGE帶型相似、ST型相同;分離于水源與人源的H_2S陰性火雞沙門菌PFGE帶型與ST型完全相同,說明不同樣本來源的沙門菌之間親緣關(guān)系密切,提示我們應(yīng)防范H_2S陰性沙門菌通過食物傳播給人類或動物。我們利用PCR技術(shù)對H_2S陰性沙門菌的phs操縱子進行擴增并進行DNA測序,從基因水平揭示沙門菌H_2S表型缺失的原因。通過比對phs操縱子序列,發(fā)現(xiàn)77株(85%)H_2S陰性沙門菌phs基因具有多種突變類型,其中74株(82%)phsA基因發(fā)生了突變。phsA基因中主要有三種突變類型:第760位的移碼突變、第1087位的移碼突變以及第1624位的錯義突變;在phsB基因中,主要有四種突變位點:第164位、第314位、第319位及第373位的錯義突變;在phsC基因中,主要有兩種突變類型:第577位的無義突變和第754位的錯義突變。這些突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物不完整或氨基酸序列改變,從而可能導(dǎo)致沙門菌失去產(chǎn)H_2S的能力�？傮w來說,H_2S陰性沙門菌的phs基因突變的多樣性,表明H_2S陰性沙門菌phs操縱子序列具有不穩(wěn)定性,但相同血清型之間phs基因序列趨于穩(wěn)定。我們利用no-SCAR(Scarless Cas9 Assisted Recombineering)基因編輯技術(shù),成功構(gòu)建了phsA基因缺失的鼠傷寒沙門菌ATCC14028突變株(ΔphsA突變株)。經(jīng)沙門/志賀瓊脂培養(yǎng)基(SS瓊脂)及醋酸鉛試紙驗證,野生株在SS瓊脂上為黑色菌落,而ΔphsA突變株為無色菌落;野生株可使醋酸鉛試紙明顯變黑,但是ΔphsA突變株卻不能。說明ΔphsA突變株無法利用培養(yǎng)基中的硫代硫酸鹽產(chǎn)生H_2S,不能與指示劑反應(yīng)生成黑色沉淀。在不同抗生素種類(諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素)及過氧化氫刺激下,通過對野生株與ΔphsA突變株生長曲線的檢測,發(fā)現(xiàn)野生株的生長水平顯著高于ΔphsA突變株,表明野生株可利用其產(chǎn)生的H_2S抵御抗生素的殺菌作用,從而耐藥生長。在抗生素或過氧化氫刺激下,野生株內(nèi)由氧化應(yīng)激作用產(chǎn)生的ROS顯著低于ΔphsA突變株,說明H_2S可通過抑制抗生素氧化應(yīng)激過程中ROS的表達,發(fā)揮細菌保護作用,從而使細菌耐藥生長。綜上所述,本研究通過開展對H_2S陰性沙門菌抗生素耐藥性及耐藥機制研究,發(fā)現(xiàn)H_2S陰性沙門菌與H_2S陽性沙門菌耐藥性的差異;對H_2S陰性沙門菌與H_2S陽性沙門菌的遺傳多態(tài)性研究,首次發(fā)現(xiàn)了兩種H_2S陰性沙門菌的ST型別,并且發(fā)現(xiàn)H_2S陰性沙門菌形成了與H_2S陽性沙門菌不同的進化分支;對H_2S參與沙門菌耐藥機制的研究,發(fā)現(xiàn)H_2S可利用其還原性清除抗生素氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的ROS,發(fā)揮細菌耐藥作用。這些研究結(jié)果對于沙門菌感染引起疾病時合理使用抗生素、傳染源溯源以及有效預(yù)防沙門菌傳播有重要的科學(xué)依據(jù),同時也為以H_2S分子作為潛在耐藥靶點和細菌耐藥的研究提供新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R378

【參考文獻】

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