本文關鍵詞：白藜蘆醇在高齡小鼠和人卵母細胞成熟中的作用研究　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：第一章：高齡小鼠卵母細胞中細胞器形態(tài)變化的研究目的高齡女性生育能力下降主要表現(xiàn)為卵母細胞數(shù)量減少和質量下降,卵母細胞質量的下降也即卵子老化。卵子老化后其細胞質中的細胞器會發(fā)生一系列的變化,從而引起卵子成熟,受精及胚胎發(fā)育的異常。本課題主要研究高齡昆明小鼠卵母細胞主要細胞器如紡錘體、染色體排列和定位的變化規(guī)律,以及線粒體和皮質顆粒分布變化規(guī)律。方法將昆明小鼠按月齡分為年輕組(4～8個月)和高齡組(48～52個月)。雌性小鼠腹腔內(nèi)注射孕馬血清促性腺激素(PMSG) 10IU/只,行超促排卵,48h后腹腔內(nèi)注射絨毛膜促性腺激素(hCG) 10IU/只,注射hCG后14h收集輸卵管的卵冠丘復合物。用80IU/m1透明質酸酶脫去卵母細胞周圍顆粒細胞,多聚甲醛固定,抗小鼠a-tubulin單克隆抗體染色紡錘體的微管,羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色微絲,FITC結合的小扁豆凝集素染色皮質顆粒,Mito Tracker Green FM染色線粒體。激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光染色的紡錘體、染色體的形態(tài)和排布,線粒體和皮質顆粒的分布變化情況。結果紡錘體和染色體：正常卵母細胞紡錘體呈完整的紡錘狀排列,形態(tài)均勻一致,染色體均勻排列在中期板內(nèi)。高齡組小鼠卵母細胞紡錘體形態(tài)異常率71.78%±1.27%,明顯高于年輕組小鼠卵母細胞紡錘體形態(tài)異常率18.93%±1.27%(P0.01)；高齡組小鼠卵母細胞染色體排列異常率65.16%±1.52%,明顯高于年輕組小鼠卵母細胞染色體的異常率32.24%±1.10%(P0.01)。微絲：年輕組小鼠其微絲分布在整個卵母細胞的胞質中,尤其在紡錘體、染色體區(qū)含量更高,染色更加明顯。高齡小鼠卵母細胞微絲多為散亂的分布于胞質中或在染色體周圍區(qū)域未見相對集中。線粒體：正常線粒體均勻分布于MII期卵母細胞的整個胞質中,于染色體附近有所聚集；對兩組線粒體熒光強度分析顯示高齡組小鼠卵母細胞熒光強度18.82±6.42明顯低于年輕組小鼠卵母細胞線粒體熒光強度44.44±32.97(P0.01)。皮質顆粒：正常卵母細胞皮質面可見皮質顆粒呈均勻細致狀分布；赤道面觀察可見皮質顆粒呈單層細致連續(xù)的光環(huán)狀分布,胞漿內(nèi)未見皮質顆粒分布,大多為成熟的皮質顆粒我們稱之為Ⅲ級皮質顆粒分布。年輕組小鼠卵母細胞Ⅲ級皮質顆粒占94.04%±0.71%。高齡組卵母細胞皮質面可見皮質顆粒呈團塊狀分布、且分布不均勻,赤道面可見皮質顆粒單層光環(huán)斷裂、呈不連續(xù)狀分布,且胞漿內(nèi)可見皮質顆粒內(nèi)遷的現(xiàn)象,多為Ⅰ級或Ⅱ級皮質顆粒(48.73%±3.28%),Ⅲ級皮質顆粒為51.00%±1.00%,明顯低于年輕組小鼠卵母細胞Ⅲ級皮質顆粒(P0.01)。結論高齡小鼠卵母細胞中各主要細胞器(紡錘體、染色體、微絲、皮質顆粒)異常率明顯增加,可能是導致高齡受孕率低的主要原因。第二章：白藜蘆醇在高齡小鼠卵母細胞成熟中的作用研究目的白藜蘆醇存在于紅葡萄酒及大部分植物中,具有抗炎癥、抗衰老、抗癌等多個生物學功能,除此之外,白藜蘆醇還有保護細胞線粒體的功能,保護細胞免受活性氧等自由基的危害,保護生育能力的功能。本課題主要研究白藜蘆醇在高齡小鼠卵母細胞成熟及胚胎形成過程中的作用；觀察白藜蘆醇對高齡小鼠卵母細胞細胞器的改善作用并探討其作用機制。方法用無菌注射器刺破高齡小鼠卵巢獲取未成熟生發(fā)泡(germinal vesical,GV)期卵母細胞,將四種不同濃度的白藜蘆醇(0,0.1,1.0,10μM/L)添加到卵母細胞體外成熟IVM (in vitro maturation)培養(yǎng)液中,16h后觀察卵母細胞的成熟情況,確定白藜蘆醇的最佳使用濃度；繼續(xù)培養(yǎng)觀察其受精,卵裂,以及囊胚形成情況；對成熟的卵母細胞進行免疫熒光染色,通過共聚焦顯微鏡觀察成熟后卵母細胞線粒體的質量、數(shù)量以及紡錘體和染色體排列的變化規(guī)律；實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測SIRT1、CAT、SOD1、GPx4基因的表達情況。結果在1.0μM/L白藜蘆醇添加組中,高齡小鼠GV期卵母細胞的成熟率為93.15%±1.46%,明顯高于其它組卵母細胞的成熟率(P0.01)。1.0μ M/L白藜蘆醇添加組中,成熟卵母細胞的受精率,囊胚形成率分別與對照組相比為：76.93%±2.40%vs 60.86%±2.13%,P0.01；58.61%±2.22% vs 41.23%±1.69%,P0.01,明顯高于對照組。另外,在1.0 μ M/L白藜蘆醇添加組中,成熟卵母細胞其線粒體的熒光強度明顯高于對照組(93.01±19.34 vs 63.06±13.11,P0.01)；且異常形態(tài)的紡錘體、異常排列的染色體率明顯低于對照組(分別為：34.42%±3.92% vs 60.69%±4.14%,P0.01；39.15%±3.91%vs 61.94%±4.82%,P0.05)。再者,添加1.0μM/L白藜蘆醇組所形成的成熟卵母細胞中,其SIRT1、抗氧化基因CAT、SOD1、GPx4的表達明顯增高。結論(1)IVM培養(yǎng)液中添加的白藜蘆醇通過改善卵母細胞線粒體的功能,降低卵母細胞紡錘體、染色體的異常率,提高SIRT1、抗氧化基因CAT、SOD1、GPx4的表達,明顯提高高齡小鼠卵母細胞的成熟率,改善卵母細胞的質量,從而提高卵母細胞的受精率及囊胚形成率。(2) 1.0μM/L為IVM培養(yǎng)液中最佳的使用濃度。第三章：白藜蘆醇在高齡女性卵母細胞體外成熟中的作用研究目的在輔助生育治療過程中,高齡女性由于卵子數(shù)量的減少以及卵子質量的下降,從而導致高齡婦女的胚胎形成率明顯下降,嚴重影響高齡患者輔助生殖治療的妊娠率以及胚胎種植率。白藜蘆醇在抗氧化、抗衰老、保護卵母細胞等一系列過程中發(fā)揮了重要的作用。本課題主要研究白藜蘆醇在高齡女性患者未成熟卵母細胞體外成熟過程中的作用,以及體外培養(yǎng)成熟后卵母細胞線粒體數(shù)量和質量的變化規(guī)律,紡錘體、染色體排列的變化規(guī)律,從而探索提高高齡女性患者未成熟卵母細胞的體外成熟率以及改善卵母細胞質量的有效培養(yǎng)環(huán)境。方法高齡女性來源于年齡大于等于38周歲于2014年2月至2015年2月就診于山東大學附屬生殖醫(yī)院的患者,其GV期卵母細胞采用因男方精子原因或其他引起受精障礙因素行卵母細胞內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的不孕癥患者中部分未成熟的卵母細胞。在高齡女性患者中將獲得的GV期卵母細胞在高齡小鼠實驗后確定的最佳白藜蘆醇添加濃度(1.0 μM/L)及對照組中培養(yǎng)24h、36h分別觀察所成熟的卵母細胞情況；對成熟的卵母細胞進行免疫熒光染色,通過共聚焦顯微鏡觀察成熟后卵母細胞線粒體的質量、數(shù)量,紡錘體、染色體排列的變化規(guī)律。結果高齡女性GV期卵母細胞在1.0μM/L白藜蘆醇添加組的未成熟卵母細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h、36h,其MII期卵母細胞的成熟率明顯高于對照組(分別為：55.26%vs 37.84%, P0.05; 71.05% vs 51.35%, P0.05)。在高齡女性1.OμM/L白藜蘆醇添加組成熟的卵母細胞其線粒體的熒光強度明顯高于對照組(53.02±15.10 vs 31.14±6.05,P0.05)；且異常形態(tài)的紡錘體、異常排列的染色體率明顯低于對照組(分別為：68.75% vs 88.89%,P0.05；68.75% vs 88.89%,P0.05)。結論白藜蘆醇的添加提高了高齡女性GV期來源的卵母細胞的成熟；提高了培養(yǎng)成熟后卵母細胞線粒體的數(shù)量,改善了線粒體的質量,并且其正常形態(tài)的紡錘體、染色體的形成率也明顯增高。因此,白藜蘆醇可有效改善高齡女性卵母細胞質量,亟待大樣本的臨床試驗進一步證實。
[Abstract]:In the first chapter , the study of the morphological changes of the organelle in the oocytes of the aged mice showed that the decrease of the number of oocytes and the decrease of the quality of the oocytes were observed . In this study , the effects of resveratrol on the maturation and formation of oocytes of mature mouse oocytes were studied . The results showed that resveratrol has the functions of resisting inflammation , anti - aging and anti - cancer . The fluorescence intensity of mitochondria in mature oocytes was significantly higher than that of the control group ( 93.01 鹵 19.34 vs 63.06 鹵 13.11 , P0.01 ) . In addition , in 1.0 渭M / L resveratrol addition group , the fluorescence intensity of mature oocytes was significantly higher than that of the control group ( 93.01 鹵 19.34 vs 63.06 鹵 13.11 , P0.01 ) . Conclusion ( 1 ) In IVM culture solution , resveratrol can improve the function of mitochondria of oocytes , reduce the abnormal rate of spindle and chromosome , improve the expression of SIRT1 , CAT , SOD1 and GPx4 , improve the maturation rate of oocytes and improve the quality of oocytes , so as to improve the fertilization rate and blastocyst formation rate of oocytes . In this study , the effect of resveratrol on the maturation of mature oocytes and the changes of the number and quality of oocytes in mature oocytes were studied . The results showed that the maturation rate of oocytes in mature oocytes was significantly higher than that in the control group ( 55.26 % vs 37.84 % , P0.05 ; 71.05 % vs 51.35 % , P0.05 ) . The fluorescence intensity of mitochondria was significantly higher than that of the control group ( 53.02 鹵 15.10 vs 31.14 鹵 6.05 , P0.05 ) . The abnormal morphology of spindle was significantly lower than that of the control group ( 68.75 % vs 88.89 % , P0.05 ; 68.75 % vs 88.89 % , P0.05 ) . Conclusion The addition of resveratrol improves the maturation of oocytes derived from GV phase of the aged female , improves the number of mitochondria in the mature oocytes , improves the quality of mitochondria , and the formation rate of the spindle and chromosome in normal form is also obviously increased . Therefore , resveratrol can effectively improve the quality of oocytes in the elderly . Therefore , the clinical trial of large samples is much more confirmed .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321

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