本文關(guān)鍵詞：miR-34b在成肌分化過(guò)程中的功能及作用機(jī)制研究　出處：《深圳大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： miR-34b NUCL 成肌細(xì)胞增殖 成肌分化 骨骼肌

【摘要】：背景:成肌分化過(guò)程包括成肌細(xì)胞的增殖,然后分化為成肌細(xì)胞,最后融合形成肌管。小鼠C2C12細(xì)胞是常用的研究成肌分化的細(xì)胞模型。microRNA(miRNA)是一類(lèi)通過(guò)靶向靶基因mRNA的3′UTR,抑制其翻譯或誘導(dǎo)其降解,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的微小非編碼RNA。已有研究表明,miRNA在成肌分化中起重要調(diào)控作用。最近,本研究鑒定了39個(gè)新的與成肌分化相關(guān)的miRNA,其中包括miR-34b。miR-34b是miR-34家族成員(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)之一,已有文獻(xiàn)表明miR-34參與和促進(jìn)多種細(xì)胞的分化,但其在成肌分化中的功能尚不清楚。目的:探究miR-34b在成肌分化過(guò)程中的功能及其調(diào)控機(jī)制。方法與結(jié)果:利用本實(shí)驗(yàn)室建立的S-Poly(T)Plus miRNA檢測(cè)技術(shù),發(fā)現(xiàn)miR-34b在成肌分化和肌肉損傷后再生過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。在C2C12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miRNA類(lèi)似物或抑制劑,發(fā)現(xiàn)miR-34b具有抑制成肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)成肌分化的功能。為探討miR-34b調(diào)控成肌細(xì)胞增殖分化的分子機(jī)制,本研究利用isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)技術(shù),在蛋白質(zhì)水平定量分析了受miR-34b調(diào)控的基因,并構(gòu)建了成肌細(xì)胞受miR-34b調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)圖。在過(guò)表達(dá)miR-34b后下調(diào)的97個(gè)蛋白中,Ywhag、Ahcy和Ncl為miR-34b潛在的靶基因(生物信息學(xué)預(yù)測(cè)),并通過(guò)了3′UTR熒光素酶報(bào)告載體的驗(yàn)證。其中,NUCL蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與細(xì)胞分化狀態(tài)密切相關(guān)。通過(guò)免疫染色和Western Blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)NUCL的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位在成肌分化過(guò)程中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA技術(shù)感染C2C12細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)干擾Ncl表達(dá)后能明顯抑制成肌細(xì)胞增殖和成肌分化。為進(jìn)一步驗(yàn)證Ncl在成肌分化中的作用,在C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染了多種靶向Ncl的siRNA,分析了nucleolin表達(dá)水平與myogenin之間的關(guān)系;結(jié)果表明,Ncl既可能促進(jìn)肌肉分化,也可能抑制肌肉分化,具體功能依賴于Ncl的蛋白表達(dá)水平。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)miR-34b在成肌分化過(guò)程中的顯著上調(diào)受甲基化調(diào)控。結(jié)論:miR-34b在成肌過(guò)程中上調(diào),抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)成肌分化,該調(diào)控作用通過(guò)靶向一系列基因(包括Ywhag、Ahcy和Ncl)而實(shí)現(xiàn)。miR-34b-Ncl軸在成肌分化調(diào)控過(guò)程中扮演重要功能。Ncl以劑量依賴性的方式調(diào)節(jié)成肌分化,而miR-34b正是以微調(diào)的方式調(diào)控Ncl在成肌分化過(guò)程中的表達(dá)水平。
[Abstract]:Background: myogenic differentiation involves the proliferation of myoblasts and then differentiation into myoblasts. Mouse C2C12 cells are commonly used to study myogenic differentiation. MicroRNAs miRNAs are a class of 3UTRs that target the target gene mRNA. Inhibition of its translation or induction of its degradation, regulation of gene expression at the post-transcriptional level of the tiny non-coding RNA. recent studies have shown that miRNA plays an important role in the regulation of myogenic differentiation. This study identified 39 new miRNAs associated with myogenic differentiation, including that miR-34b.miR-34b is a member of the miR-34 family (including miR-34a). MiR-34b and miR-34c), it has been reported that miR-34 participates in and promotes the differentiation of many kinds of cells. But its function in myogenic differentiation is not clear. Objective: to explore the function and regulatory mechanism of miR-34b in myogenic differentiation. Plus miRNA detection technology. It was found that the expression of miR-34b was up-regulated during myogenic differentiation and regeneration after muscle injury. The chemically synthesized miRNA analogues or inhibitors were transfected into C2C12 cells. It was found that miR-34b could inhibit the proliferation of myoblasts and promote the differentiation of myoblasts. In order to investigate the molecular mechanism of miR-34b regulating the proliferation and differentiation of myoblasts. In this study, isobaric tags for relative and absolute quantitative analysis (iTRAQ) technique was used. The genes regulated by miR-34b were quantitatively analyzed at the protein level, and a network map of myoblasts regulated by miR-34b was constructed. Among 97 proteins down-regulated after overexpression of miR-34b. Ywhagar Ahcy and Ncl are potential target genes for miR-34b (bioinformatics predictor) and have been verified by 3TUTR luciferase report vector. The expression trend of NUCL protein was closely related to the differentiation of cells. The expression of NUCL protein was detected by immunostaining and Western Blot. It was found that the expression and intracellular localization of NUCL showed dynamic changes during myogenic differentiation. C2C12 cells were infected with shRNA mediated by lentivirus. It was found that interfering with the expression of Ncl could significantly inhibit the proliferation and myogenic differentiation of myoblasts. In order to further verify the role of Ncl in myogenic differentiation. Several siRNAs targeting Ncl were transfected into C2C12 cells, and the relationship between nucleolin expression and myogenin was analyzed. The results showed that NCL could promote or inhibit muscle differentiation, and its specific function depended on the protein expression level of Ncl. It was also found that the upregulation of miR-34b during myogenic differentiation was regulated by methylation. Conclusion: miR-34b is up-regulated during myogenesis, which inhibits cell proliferation and promotes myogenic differentiation. This regulation is mediated by targeting a series of genes (including Ywhag). Ahcy and NCL). The .miR-34b-NCL axis plays an important role in the regulation of myogenic differentiation. NCL regulates myogenic differentiation in a dose-dependent manner. MiR-34b regulates the expression of Ncl during myogenic differentiation in a fine-tuned manner.
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R3416

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