發(fā)布時(shí)間：2018-01-04 14:49

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)CCDC67轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建及意義　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景和目的近些年,甲狀腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增高的趨勢(shì),約占人類所有惡性腫瘤的2%,且是內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)病率最高的腫瘤,女性發(fā)病率顯著高于男性。甲狀腺癌根據(jù)病理分型可分為:甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、未分化甲狀腺癌和甲狀腺髓樣癌。其中甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺濾泡狀癌統(tǒng)稱為分化型甲狀腺癌,甲狀腺乳頭狀癌約占甲狀腺癌病理分型中的95%。近些年研究及臨床經(jīng)驗(yàn)表明,大部分的分化型甲狀腺癌經(jīng)規(guī)范的治療后預(yù)后較好,長(zhǎng)期生存率高達(dá)90%左右。但分化型甲狀腺癌仍然具有著相對(duì)較高的轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展,甲狀腺癌相關(guān)的分子學(xué)標(biāo)志物被逐步發(fā)現(xiàn)。其中抑癌基因的失活和凋亡調(diào)控基因表達(dá)水平失衡是甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中兩個(gè)重要的過(guò)程。最新的研究證實(shí),卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白67基因在分子細(xì)胞學(xué)水平被初步證實(shí)為一個(gè)新的抑癌基因,且與BRAF基因突變、Bcl-2/Bax表達(dá)水平存在一定關(guān)聯(lián)。因此,本實(shí)驗(yàn)首先用免疫組化法在臨床手術(shù)切除的甲狀腺癌及癌旁組織中檢測(cè)了CCDC67蛋白、Bcl-2蛋白的表達(dá)情況,分析蛋白表達(dá)與臨床病例特征的相關(guān)性。然后通過(guò)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的CCDC67過(guò)表達(dá)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株,構(gòu)建甲狀腺乳頭狀癌裸鼠荷瘤模型,通過(guò)活體成像技術(shù)確認(rèn)細(xì)胞株成瘤效果,處死裸鼠后分析瘤重、體積,計(jì)算抑瘤率。接著,我們將瘤體進(jìn)行石蠟包埋,通過(guò)HE染色確定病理類型;通過(guò)免疫組化SP法檢測(cè)鼠瘤組織切片中CCDC67蛋白、Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Caspase3蛋白、β-catenin蛋白、Cox2蛋白的表達(dá)情況,以初步探索過(guò)轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組成瘤結(jié)果存在差異性的機(jī)制。最后,通過(guò)TUNEL法檢測(cè)鼠瘤組織切片中細(xì)胞凋亡情況,并分析轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組的凋亡指數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)旨在探索CCDC67基因在裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng),并初步分析其在體內(nèi)作用的分子機(jī)制。材料與方法1.收集57例臨床手術(shù)切除的甲狀腺癌及癌旁組織標(biāo)本。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)CCDC67基因,Bcl-2基因在甲狀腺癌患者癌組織切片中的表達(dá)情況,分析二者及臨床病理特征的相關(guān)性。2.構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)CCDC67過(guò)表達(dá)TPC-1細(xì)胞株OE,空載體病毒構(gòu)建細(xì)胞株NC。3.TPC-1細(xì)胞株接種3只BALB/c裸鼠,初步構(gòu)建TPC-1裸鼠荷瘤模型,確認(rèn)TPC-1細(xì)胞株裸鼠成瘤的可行性。轉(zhuǎn)染細(xì)胞株OE、空載體細(xì)胞株NC、空白對(duì)照細(xì)胞株CON(TPC-1)接種3組各10只BALB/c雌性裸鼠,活體成像技術(shù)檢測(cè)OE、NC鼠瘤體熒光峰值,觀察至接種第20天處死裸鼠取瘤體稱重,根據(jù)瘤體重量、體積分析計(jì)算抑瘤率及三組細(xì)胞株成瘤結(jié)果差異。4.裸鼠處死后摘除瘤體,RT-PCR及免疫組化法確認(rèn)瘤體內(nèi)CCDC67的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)三個(gè)細(xì)胞株構(gòu)建所得成瘤模型的瘤體中CCDC67、Bcl-2、Bax、caspase-3、cox-2及β-catenin蛋白的表達(dá)情況,并用Image J軟件分析差異。5.采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,單因素方差分析對(duì)多樣本均屬進(jìn)行比較,用t檢驗(yàn)分析兩定量樣本,用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本率的比較,以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.57例PTC組織中CCDC67蛋白表達(dá)率為43.86%(25/57),表達(dá)率為明顯低于癌旁組織的表達(dá)率100%(57/57),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05);BCL2-蛋白在癌組織表達(dá)率為57.89%(33/57),高于在正常組織中的表達(dá)率15.79%(9/57)(P㩳0.05)。CCDC67基因的低表達(dá)與Bcl-2的高表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.400,P㩳0.05)。2.Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)OE組細(xì)胞凋亡水平高于CON組和NC組(P㩳0.05)。3.甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC-1具有構(gòu)建裸鼠荷瘤模型的生物學(xué)效應(yīng),選擇該細(xì)胞株構(gòu)建裸鼠荷瘤模型存在可行性。4.OE組瘤體平均重量明顯低于CON組及NC組平均瘤體重量(P㩳0.05),CON組瘤體平均重量與NC組瘤體平均重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。OE組荷瘤裸鼠活體成像熒光總量、單位面積熒光量均低于NC組(P㩳0.05)。5.OE組裸鼠瘤體組織中呈現(xiàn)出CCDC67mRNA高表達(dá),而CON組和NC組裸鼠瘤體mRNA呈現(xiàn)出CCDC67mRNA表達(dá)缺失(P㩳0.05)。6.免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,CCDC67在全部OE組瘤體組織切片中呈現(xiàn)高表達(dá),在NC組和CON組表達(dá)水平低于OE組(P㩳0.05);Bax蛋白在OE組瘤體組織切片中的表達(dá)水平高于CON組和NC組,而CON組與NC組之間表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05);Bcl-2蛋白在OE組瘤體組織切片中的表達(dá)水平低于CON組和NC組,而CON組與NC組之間表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05);β-catenin蛋白在OE組瘤體組織切片中表達(dá)異常率低于CON組和NC組,而CON組與NC組之間表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。結(jié)論:在臨床手患者經(jīng)手術(shù)切除的甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本中CCD67基因的表達(dá)出現(xiàn)缺失,其表達(dá)缺失情況與對(duì)應(yīng)患者的腫瘤大小、腫瘤TNM分期、臨床病理分級(jí)存在相關(guān);Bcl-2基因的表達(dá)出現(xiàn)缺失,其表達(dá)缺失情況與對(duì)應(yīng)患者的腫瘤TNM分期、臨床病理分級(jí)存在相關(guān);且CCDC67與Bcl-2基因的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。利用慢病毒介導(dǎo)的CCDC67基因轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞株所構(gòu)建的裸鼠荷瘤模型中,CCDC67高表達(dá)組的瘤體體積、重量、生長(zhǎng)速度均受到抑制,且根據(jù)蛋白Bax/Bcl-2的檢測(cè)、Caspase-3、wnt通路中β-catenin及Cox-2蛋白的檢測(cè)結(jié)果,提示CCDC67可能參與了腫瘤的發(fā)生及凋亡機(jī)制的調(diào)控。結(jié)合前期的體外細(xì)胞學(xué)及分子學(xué)實(shí)驗(yàn),完全可以證明CCDC67基因是一個(gè)新的抑癌基因。但CCDC67基因所涉及的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子學(xué)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : In recent years , the incidence of thyroid cancer has been increasing year by year , which accounts for about 2 % of all human malignant tumors , and is the highest in the endocrine system . The expression of C67 , Bcl - 2 , Bax , caspase - 3 , cox - 2 and 尾 - catenin in nude mice were determined by immunohistochemical SP method . The expression of C67 , Bcl - 2 , Bax , caspase - 3 , cox - 2 and 尾 - catenin in nude mice were significantly lower than those in control group ( P ? 0.05 ) . The growth rate was inhibited , and the results of the detection of Bax / Bcl - 2 , 尾 - catenin and Cox - 2 protein in the caspase - 3 and wnt pathway suggested that C67 might be involved in the genesis of the tumor and the mechanism of apoptosis . In combination with the in vitro cytology and molecular experiment , it is possible to demonstrate that the C67 gene is a new tumor suppressor gene . However , the molecular mechanism of the specific signal transduction pathway involved in the C67 gene still needs to be further studied .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R736.1;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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2 許建輝;慢病毒介導(dǎo)CCDC67轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生物學(xué)活性的鑒定[D];鄭州大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1378857