本文關(guān)鍵詞：微小核糖核酸在疾病發(fā)生發(fā)展以及藥物療效預(yù)測(cè)中的作用機(jī)制　出處：《南京大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控小分子,大小約19--23個(gè)堿基,miRNA特異性地結(jié)合到靶標(biāo)mRNA的3’非翻譯區(qū),在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),對(duì)靶基因的調(diào)控呈負(fù)調(diào)控。越來(lái)越多研究表明,miRNA的異常表達(dá)在各種疾病的發(fā)生發(fā)展扮演著重要的角色。它不僅能在組織中調(diào)控疾病相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因；也能夠通過(guò)微囊泡(microvesicles, MVs)的傳遞作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的相互作用；并且血清中穩(wěn)定存在的miRNA可以作為預(yù)測(cè)、診斷疾病發(fā)生的生物標(biāo)志物。本論文主要從以上這三個(gè)方面,探討miRNA在疾病中的功能與應(yīng)用研究。首先我們研究血小板來(lái)源的miRNA通過(guò)MV介質(zhì)傳遞并影響內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)人的血小板細(xì)胞中富含數(shù)量巨大的miRNA前體和成熟體,在炎癥因子的刺激下,血小板中的miRNA前體可以轉(zhuǎn)化為成熟體,其中以miR-223的基礎(chǔ)含量最高,變化倍數(shù)最為顯著。同時(shí),刺激后的血小板釋放出大量包裹有miR-223的MV。這些MV能夠進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中,并且將miR-223導(dǎo)入HUVEC細(xì)胞中。血小板來(lái)源的miR-223能夠降低HUVEC細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)HUVEC在糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)誘導(dǎo)下引起的凋亡。其次我們開(kāi)展了血清中人類巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)編碼的miRNA-US4-1作為預(yù)測(cè)干擾素a(interferon a, IFNa)治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的生物標(biāo)志物的臨床研究。我們收集了56例干擾素治療前的乙肝病人血清,并通過(guò)跟蹤其治療后的血液生化指標(biāo)將其分為有效組和無(wú)效組。用定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan探針)對(duì)20例樣本(有效組、無(wú)效組各10人)進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè),初篩出5種穩(wěn)定的表達(dá)差異顯著的HCMV miRNA;接著對(duì)另外36例樣本(有效組、無(wú)效組各18人)進(jìn)行復(fù)篩,進(jìn)一步篩選出有顯著差異的2種HCMV miRNA,并用對(duì)干擾素療效預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積達(dá)1.00的miR-US4-1進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn),進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn),通過(guò)檢測(cè)hcmv-mir-US4-1在96例干擾素α療效未知的乙肝病人血清中的表達(dá)量,判斷干擾素治療乙肝的療效并驗(yàn)證其正確率,發(fā)現(xiàn)在有效組和無(wú)效組正確率分別達(dá)到84%和72%。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血清中HCMV編碼的miRNA-US4-1可以作為預(yù)測(cè)IFNa治療慢性乙肝療效的生物標(biāo)志物。最后,我們研究了成熟miRNA的作用方式及其對(duì)癌癥進(jìn)程的影響。我們首先研究了miR-200b和miR-200c促進(jìn)大腸癌增殖的作用方式和機(jī)制,熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-200b/c在大腸癌組織中顯著升高。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示,回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元RECK是miR-200b/c的靶基因,并且在大腸癌組織中表達(dá)下調(diào)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-200b/c可與RECK mRNA的3'-UTR結(jié)合。在大腸癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)或抑制miR-200b/200,可相應(yīng)降低或升高RECK蛋白水平,導(dǎo)致RECK/SKP2/p27Kip1信號(hào)通路的變化,最終影響大腸癌細(xì)胞增殖能力。RECK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒缺少3'-UTR,因此其表達(dá)不受miRNA調(diào)節(jié),可回復(fù)miR-200b/c對(duì)RECK的抑制作用,解除miR-200b/c對(duì)上述信號(hào)通路的影響和對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。最后通過(guò)小鼠植瘤模型進(jìn)一步證實(shí)了,miR-200b/c可以通過(guò)調(diào)節(jié)RECK蛋白的表達(dá)從而調(diào)控大腸癌細(xì)胞的增殖和植瘤的體積大小以及惡性程度。而恢復(fù)RECK蛋白的表達(dá)可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力、腫瘤的體積大小以及惡性程度,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為大腸癌的治療提供了全新的思路。另外,我們還研究了miR-221促進(jìn)乳腺癌遷移的作用方式和機(jī)制。通過(guò)比較我們發(fā)現(xiàn)惡性程度較高的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)E-鈣黏素(E-cadherin,E-cad)蛋白表達(dá)明顯低于惡性程度較低的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。但轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中的E-cadherin過(guò)表達(dá)質(zhì)�？梢赞D(zhuǎn)錄出的E-cadherin mRNA卻不能翻譯出E-cadherin蛋白,向MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染E-cadherin過(guò)表達(dá)質(zhì)�？梢员磉_(dá)出E-cadherin蛋白。結(jié)合過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特征以及本課題組長(zhǎng)期miRNA研究經(jīng)驗(yàn),我們推測(cè)在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)存在一種"miRNA/E-cad ORF"新調(diào)控機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)我們篩選出了可能與E-cad ORF結(jié)合的8種miRNA。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-221在乳腺癌組織、惡性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和TGF-β誘導(dǎo)處理促惡化后的MCF-7細(xì)胞中均發(fā)生顯著上調(diào)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-221可與E-cadherin mRNA的ORF結(jié)合。在MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-221或在MDA-MB-231細(xì)胞中抑制miR-221,可相應(yīng)降低或升高E-cadherin蛋白水平,在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染E-cadherin突變質(zhì)粒(miR-221結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行同義突變)或者共轉(zhuǎn)染E-cadherin野生型質(zhì)粒和miR-221抑制劑(anti-miR-221)后也可以提高E-cadherin蛋白水平,最終影響乳腺癌的遷移、侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),E-cadherin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Slug高表達(dá)不僅能在轉(zhuǎn)錄前水平抑制E-cadherin mRNA的表達(dá),還可以通過(guò)上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miR-221的表達(dá),進(jìn)一步抑制E-cadherin mRNA的翻譯,從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移。最后我們通過(guò)尾靜脈注射的方式將不同處理的MDA-MB-231細(xì)胞輸送進(jìn)小鼠體內(nèi),觀察腫瘤遷移能力和成瘤情況,進(jìn)一步證實(shí)了通過(guò)抑制miR-221的表達(dá)或者表達(dá)E-cadherin突變型質(zhì)粒可以提高乳腺癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)量并抑制其遷移能力,為預(yù)防乳腺癌的轉(zhuǎn)移提供了新的策略。綜上所述,我們研究了miRNA調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展的不同方式和機(jī)制,探索了miRNA與疾病治療的相關(guān)性,我們的發(fā)現(xiàn)具有重大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:寰皬鏍哥硸鏍擱吀(microRNA, miRNA)鏄繎騫存潵鍙戠幇鐨勪竴縐嶆柊鍨嬪熀鍥犺漿褰曞悗璋冩帶灝忓垎瀛，

本文編號(hào)：1376787