本文關鍵詞：微小核糖核酸在疾病發(fā)生發(fā)展以及藥物療效預測中的作用機制　出處：《南京大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控小分子,大小約19--23個堿基,miRNA特異性地結(jié)合到靶標mRNA的3’非翻譯區(qū),在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,對靶基因的調(diào)控呈負調(diào)控。越來越多研究表明,miRNA的異常表達在各種疾病的發(fā)生發(fā)展扮演著重要的角色。它不僅能在組織中調(diào)控疾病相關信號通路中的關鍵基因；也能夠通過微囊泡(microvesicles, MVs)的傳遞作為信號分子調(diào)節(jié)細胞之間的相互作用；并且血清中穩(wěn)定存在的miRNA可以作為預測、診斷疾病發(fā)生的生物標志物。本論文主要從以上這三個方面,探討miRNA在疾病中的功能與應用研究。首先我們研究血小板來源的miRNA通過MV介質(zhì)傳遞并影響內(nèi)皮細胞功能的機制。我們發(fā)現(xiàn)人的血小板細胞中富含數(shù)量巨大的miRNA前體和成熟體,在炎癥因子的刺激下,血小板中的miRNA前體可以轉(zhuǎn)化為成熟體,其中以miR-223的基礎含量最高,變化倍數(shù)最為顯著。同時,刺激后的血小板釋放出大量包裹有miR-223的MV。這些MV能夠進入血管內(nèi)皮細胞HUVEC中,并且將miR-223導入HUVEC細胞中。血小板來源的miR-223能夠降低HUVEC細胞中胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)的表達,進而促進HUVEC在糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)誘導下引起的凋亡。其次我們開展了血清中人類巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)編碼的miRNA-US4-1作為預測干擾素a(interferon a, IFNa)治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的生物標志物的臨床研究。我們收集了56例干擾素治療前的乙肝病人血清,并通過跟蹤其治療后的血液生化指標將其分為有效組和無效組。用定量實時熒光定量PCR(TaqMan探針)對20例樣本(有效組、無效組各10人)進行逐個檢測,初篩出5種穩(wěn)定的表達差異顯著的HCMV miRNA;接著對另外36例樣本(有效組、無效組各18人)進行復篩,進一步篩選出有顯著差異的2種HCMV miRNA,并用對干擾素療效預測的ROC曲線下面積達1.00的miR-US4-1進行雙盲實驗,進行雙盲實驗,通過檢測hcmv-mir-US4-1在96例干擾素α療效未知的乙肝病人血清中的表達量,判斷干擾素治療乙肝的療效并驗證其正確率,發(fā)現(xiàn)在有效組和無效組正確率分別達到84%和72%。我們的實驗結(jié)果表明血清中HCMV編碼的miRNA-US4-1可以作為預測IFNa治療慢性乙肝療效的生物標志物。最后,我們研究了成熟miRNA的作用方式及其對癌癥進程的影響。我們首先研究了miR-200b和miR-200c促進大腸癌增殖的作用方式和機制,熒光實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-200b/c在大腸癌組織中顯著升高。生物信息學預測顯示,回復引導半胱氨酸豐富蛋白Kazal基元RECK是miR-200b/c的靶基因,并且在大腸癌組織中表達下調(diào)。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明miR-200b/c可與RECK mRNA的3'-UTR結(jié)合。在大腸癌細胞系中過表達或抑制miR-200b/200,可相應降低或升高RECK蛋白水平,導致RECK/SKP2/p27Kip1信號通路的變化,最終影響大腸癌細胞增殖能力。RECK過表達質(zhì)粒缺少3'-UTR,因此其表達不受miRNA調(diào)節(jié),可回復miR-200b/c對RECK的抑制作用,解除miR-200b/c對上述信號通路的影響和對大腸癌細胞增殖能力的影響。最后通過小鼠植瘤模型進一步證實了,miR-200b/c可以通過調(diào)節(jié)RECK蛋白的表達從而調(diào)控大腸癌細胞的增殖和植瘤的體積大小以及惡性程度。而恢復RECK蛋白的表達可以顯著降低腫瘤細胞的增殖能力、腫瘤的體積大小以及惡性程度,該實驗結(jié)果為大腸癌的治療提供了全新的思路。另外,我們還研究了miR-221促進乳腺癌遷移的作用方式和機制。通過比較我們發(fā)現(xiàn)惡性程度較高的乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞內(nèi)E-鈣黏素(E-cadherin,E-cad)蛋白表達明顯低于惡性程度較低的乳腺癌細胞系MCF-7。但轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細胞中的E-cadherin過表達質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)錄出的E-cadherin mRNA卻不能翻譯出E-cadherin蛋白,向MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染E-cadherin過表達質(zhì)�？梢员磉_出E-cadherin蛋白。結(jié)合過表達質(zhì)粒的結(jié)構特征以及本課題組長期miRNA研究經(jīng)驗,我們推測在乳腺癌細胞內(nèi)存在一種"miRNA/E-cad ORF"新調(diào)控機制。通過生物信息學預測我們篩選出了可能與E-cad ORF結(jié)合的8種miRNA。通過熒光實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-221在乳腺癌組織、惡性乳腺癌細胞系MDA-MB-231和TGF-β誘導處理促惡化后的MCF-7細胞中均發(fā)生顯著上調(diào)。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明miR-221可與E-cadherin mRNA的ORF結(jié)合。在MCF-7細胞中過表達miR-221或在MDA-MB-231細胞中抑制miR-221,可相應降低或升高E-cadherin蛋白水平,在MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染E-cadherin突變質(zhì)粒(miR-221結(jié)合位點進行同義突變)或者共轉(zhuǎn)染E-cadherin野生型質(zhì)粒和miR-221抑制劑(anti-miR-221)后也可以提高E-cadherin蛋白水平,最終影響乳腺癌的遷移、侵襲能力。進一步研究發(fā)現(xiàn),E-cadherin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Slug高表達不僅能在轉(zhuǎn)錄前水平抑制E-cadherin mRNA的表達,還可以通過上調(diào)乳腺癌細胞中miR-221的表達,進一步抑制E-cadherin mRNA的翻譯,從而促進乳腺癌細胞的遷移。最后我們通過尾靜脈注射的方式將不同處理的MDA-MB-231細胞輸送進小鼠體內(nèi),觀察腫瘤遷移能力和成瘤情況,進一步證實了通過抑制miR-221的表達或者表達E-cadherin突變型質(zhì)�？梢蕴岣呷橄侔┘毎鸈-cadherin的表達量并抑制其遷移能力,為預防乳腺癌的轉(zhuǎn)移提供了新的策略。綜上所述,我們研究了miRNA調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展的不同方式和機制,探索了miRNA與疾病治療的相關性,我們的發(fā)現(xiàn)具有重大的臨床應用價值。
[Abstract]:寰皬鏍哥硸鏍擱吀(microRNA, miRNA)鏄繎騫存潵鍙戠幇鐨勪竴縐嶆柊鍨嬪熀鍥犺漿褰曞悗璋冩帶灝忓垎瀛，

本文編號：1376787