本文關(guān)鍵詞：大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型和饑餓模型尿液蛋白質(zhì)組研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的生物標(biāo)志物指的是與生理或病理性過程相關(guān)的可監(jiān)測的變化。在受到多種生理或病理性的因素刺激時,機(jī)體內(nèi)原有的平衡狀態(tài)被打破,相關(guān)器官、組織或細(xì)胞會產(chǎn)生異常的代謝產(chǎn)物。機(jī)體總是趨向于恢復(fù)原有的平衡,故而會將這些異常的代謝產(chǎn)物排出體外。尿液作為機(jī)體的一種排泄物很有可能承載和積累了這些來自于機(jī)體的多種變化,并可能是尋找生物標(biāo)志物良好的生物學(xué)來源。在研究某種疾病特異性生物標(biāo)志物時,為了排除尿液蛋白質(zhì)組中其它生理或病理影響因素,應(yīng)選擇單一生理或病理因素變化所對應(yīng)的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的特異性變化進(jìn)行研究,更有利于發(fā)現(xiàn)與該疾病直接相關(guān)的、有重要意義的尿液蛋白生物標(biāo)志物。直接使用人的臨床尿液樣品來研究某種疾病所導(dǎo)致的尿液蛋白質(zhì)特異性的變化存在著許多困難,尿液的諸多影響因素所引起的變化很可能掩蓋或至少部分掩蓋了疾病本身所引起的變化。直接使用這種方法來研究人類疾病尿液蛋白組學(xué),往往需要大規(guī)模的樣本量,極其耗時,而且難以獲得可信的結(jié)果。因此選擇動物模型這-更為簡單、可控的研究系統(tǒng)進(jìn)行研究,對于尿液蛋白組學(xué)的研究即尋找可信的尿液標(biāo)志物來講不失為一種更好的選擇。進(jìn)展性腎臟疾病多導(dǎo)致終末期腎損傷,而腎臟纖維化是其基本的病理學(xué)改變。臨床上梗阻性腎病是腎臟纖維化的一大重要原因,以腎小管損傷和間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖為主要特征,因此尋找腎小管損傷和腎臟纖維化尿液生物標(biāo)志物對于梗阻性腎病及其它慢性腎病的診治具有重要意義。單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)模型被認(rèn)為是梗阻性腎病經(jīng)典的動物模型,其實驗時間、造模嚴(yán)重程度可控性好。本研究采用UUO模型來研究梗阻性腎病不同病理狀態(tài)下的尿液蛋白質(zhì)組的變化,并驗證了UUO模型大鼠腎小管損傷和腎間質(zhì)纖維化兩個病理過程所對應(yīng)的尿液中幾種顯著變化的差異蛋白,為篩選和尋找梗阻性腎病潛在的尿液生物標(biāo)志物提供了一定的線索。饑餓是生物體的一種正常生理現(xiàn)象,在此過程中,器官功能可發(fā)生不同程度的異常,而能量代謝亦會出現(xiàn)一系列的變化,引起體重下降、身體組成成分的變化以及代謝基因表達(dá)的改變。短期饑餓可能導(dǎo)致蛋白代謝的加速,引起尿液中氮排泄量增加、體內(nèi)亮氨酸通量和氧化增加,這些均提示饑餓能夠影響機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝,而這些變化很可能從尿液蛋白質(zhì)組的變化中體現(xiàn)出來。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是指活細(xì)胞內(nèi)的基因組經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯為蛋白質(zhì)后,在蛋白質(zhì)的一個或多個氨基酸殘基上進(jìn)行共價修飾的過程,在生命體中具有重要的意義。翻譯后修飾的蛋白在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要的作用,并且翻譯后修飾的類型和程度會因機(jī)體所處的不同環(huán)境、機(jī)體不同的生理和病理狀態(tài)的影響而出現(xiàn)巨大的變化。因此,對于饑餓過程中尿液蛋白質(zhì)組的研究不應(yīng)只局限于對尿液蛋白質(zhì)組成和含量變化的研究,還應(yīng)關(guān)注這些尿液蛋白質(zhì)的翻譯后修飾類型、程度以及修飾位點的差異,這對于理解饑餓所導(dǎo)致機(jī)體的一系列變化有重要的意義。因此本實驗主要研究了大鼠饑餓0、4、7d時尿液蛋白質(zhì)組的變化以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化。方法1.實驗分為假手術(shù)組和UUO模型組,其中UUO模型組采用分離大鼠左側(cè)輸尿管進(jìn)行雙結(jié)扎造模,假手術(shù)組只分離左側(cè)輸尿管不進(jìn)行其它操作。造模成功后,尿液的采集是通過與腎臟相連的輸尿管殘端進(jìn)行輸尿管插管,共收取尿液3小時,其中前0.5小時尿液為腎臟在造模階段儲積的尿液,該部分尿液不進(jìn)行分析；后2.5小時尿液為損傷腎臟新產(chǎn)生的尿液并用于后續(xù)蛋白組學(xué)研究。這種方法采集的尿液與梗阻性腎病患者的尿液有一定的相似性。尿液采集完成后,腹主動脈采血,并收取造模側(cè)腎臟用于后續(xù)研究。提取尿蛋白進(jìn)行膜上酶切,用質(zhì)譜定量的方法研究模型不同病理變化所對應(yīng)的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的變化,篩選有意義的差異蛋白,在各組尿液、腎組織內(nèi)進(jìn)行western blot和免疫組織化學(xué)驗證。2.實驗研究了大鼠饑餓不同時間后尿液蛋白質(zhì)組的變化,分別在大鼠饑餓0、4、7d時測量大鼠體重,觀察體重的變化,并收取大鼠的尿液和血液進(jìn)行生化檢測,觀察生化指標(biāo)的異常情況；質(zhì)譜檢測饑餓不同時間點大鼠尿液蛋白質(zhì)組的變化,包括蛋白組成相對量的變化以及翻譯后修飾的變化。結(jié)果1.HE和Masson染色證明造模成功后,采用質(zhì)譜定量方法研究了腎小管損傷所對應(yīng)的UUO模型較早階段(UUO模型1w)和腎間質(zhì)纖維化所對應(yīng)的UUO模型較晚階段(UUO模型3w)大鼠尿液蛋白質(zhì)組的變化。共鑒定到尿蛋白500個,其中與對照組1w組相比,UUO模型1w組顯著變化的蛋白共7個,與對照3w組比較,UUO模型3w組顯著變化的蛋白共18個。選擇5個在UUO模型中出現(xiàn)顯著變化的尿蛋白,在尿液和腎組織中進(jìn)行驗證。尿液蛋白western blot驗證以及腎組織western blot和免疫組織化學(xué)驗證顯示,Alpha-actinin-1和Moesin蛋白水平在UUO模型1w組即可出現(xiàn)升高,而Vimentin, Annexin A1和Clusterin蛋白水平在UUO模型3w組有所升高。2.隨饑餓時間延長,大鼠體重以及每日排尿量均降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。尿液、血漿生化檢測發(fā)現(xiàn)尿肌酐水平顯著升高、血漿總蛋白水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用質(zhì)譜定量方法研究了饑餓不同時間點0、4、7d時大鼠尿液蛋白質(zhì)組的變化。共鑒定到尿蛋白664個,其中與饑餓0天相比,饑餓4天顯著變化的蛋白共5個,饑餓7d顯著變化的蛋白共13個,其中有3個蛋白重合；同時,饑餓后尿蛋白的翻譯后修飾也會發(fā)生一系列的變化。結(jié)論1.在UUO模型1w組出現(xiàn)顯著變化的尿蛋白可能作為腎小管損傷這一病理過程潛在的尿液生物標(biāo)志物,在UUO模型3w組出現(xiàn)顯著變化的尿蛋白可能作為腎間質(zhì)纖維化這一病理過程潛在的尿液生物標(biāo)志物。2.饑餓可能通過影響機(jī)體的代謝而引起尿液蛋白質(zhì)組在量和翻譯后修飾上的一系列變化。饑餓所對應(yīng)的發(fā)生特異性改變的尿蛋白可作為疾病生物標(biāo)志物研究中應(yīng)被排除的干擾蛋白,更有利于發(fā)現(xiàn)特異性的疾病尿液生物標(biāo)志物。翻譯后修飾的變化主要是甲�；土姿峄牡鞍讛�(shù)量減少,對于探討尿液中蛋白質(zhì)存在的意義提供一定線索。
[Abstract]:In order to study the changes of urine protein specific in urine protein group , it is very important to study the changes of urine protein specific in urine protein group . The levels of alpha - actinin - 1 and Moesin protein were increased in the UUO model 1w group . The levels of vimentin , annexin A1 and the protein were increased in the UUO model 3w group .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R691;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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