本文關(guān)鍵詞：人類冠狀病毒OC43（HCoV-OC43）輔助蛋白ns12.9的生理功能和分子機制研究　出處：《蘇州大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：冠狀病毒(CoVs)是具有包膜的,單股正鏈RNA病毒。冠狀病毒在自然界中分布廣泛,在人、哺乳類和鳥類中都存在,通常造成呼吸道和胃腸道的感染疾病,但某些物種的冠狀病毒也能夠?qū)е赂闻K或神經(jīng)系統(tǒng)感染,由此可知冠狀病毒是一種在臨床醫(yī)學和獸醫(yī)學中都應(yīng)受到重視的致病病毒。雖然人類冠狀病毒早在十九世紀六十年代就已被發(fā)現(xiàn),但是直到2003年高致病性SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的全球大流行,人類冠狀病毒的研究才受到廣泛關(guān)注和重視。冠狀病毒基因組除了編碼結(jié)構(gòu)蛋白外(如replicase、S、E、M和N),在其結(jié)構(gòu)基因之間還穿插著一系列的輔助蛋白基因。冠狀病毒輔助蛋白具有病毒毒株特異性,其輔助蛋白基因個數(shù)從最少的一個(HCoV-NL63)到最多的八個(SARS-CoV)。有趣的是,有且只有一個輔助蛋白基因是在所有冠狀病毒中都存在的,那就是在S與E基因之間的輔助蛋白基因,我們稱之為SNE基因�？紤]到SNE基因的這一特異性,我們推測其在冠狀病毒感染過程中可能發(fā)揮著重要的、保守的功能。我們實驗室之前的工作發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV的SNE蛋白3a具有病毒離子通道的功能,并通過某種未知的機制來調(diào)控病毒的增殖。病毒離子通道蛋白是一類病毒編碼的小分子疏水性蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)在多種RNA病毒和DNA病毒中都能編碼表達,如甲型流感病毒的M2蛋白、人類免疫缺陷病毒I型的Vpu蛋白和JC多瘤病毒的agnoprotein蛋白等。病毒離子通道蛋白具有一些分子共性,包括膜定位、同源寡聚化和離子通道活性等。病毒離子通道蛋白插入到宿主細胞膜上會形成親水性孔道,介導一些離子或者小分子通過,改變細胞的生理穩(wěn)態(tài),從而有助于病毒感染生活周期的多個階段的有利進行。考慮到病毒離子通道蛋白對病毒感染的重要性,病毒離子通道蛋白無疑是一個非常有應(yīng)用前景的抗病毒治療靶點。目前,已有公司開發(fā)出一些針對病毒離子通道蛋白的離子通道抑制劑作為抗病毒藥物,并進入了臨床試驗。此外,基于病毒離子通道蛋白缺失突變病毒來開發(fā)減毒疫苗也是一個非常有前景的選擇。人類冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)是在上世紀60年代從一位普通感染病人中分離出來的。除了是普通感冒的主要病原體之一,HCoV-OC43感染免疫低下病人或老人時會引發(fā)肺炎甚至死亡,這也說明了HCoV-OC43病毒感染致病機理研究的重要性。通過對病毒基因組堿基序列分析發(fā)現(xiàn),hcov-oc43的sne基因編碼了一個分子量為12.9kda的小分子蛋白,并命名為ns12.9。但是有關(guān)ns12.9蛋白在hcov-oc43病毒感染過程中是否發(fā)揮作用還是未知的。在本課題研究中,我們通過反向遺傳學系統(tǒng)構(gòu)建了ns12.9蛋白缺失的突變病毒hcov-oc43-Δns12.9來探究在病毒感染時ns12.9蛋白的功能。利用電生理平臺,我們發(fā)現(xiàn)ns12.9蛋白能夠在細胞膜上發(fā)生同源寡聚化形成離子通道,說明了ns12.9蛋白同sars-3a蛋白一樣,是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒離子通道蛋白。突變病毒hcov-oc43-Δns12.9在體外細胞中和小鼠體內(nèi)都表現(xiàn)出增殖缺陷,相比于野生型病毒hcov-oc43-wt,其病毒滴度下降了至少10倍,這一現(xiàn)象證實了病毒離子通道蛋白ns12.9在hcov-oc43病毒感染時發(fā)揮著非常重要的作用,參與感染性病毒粒子的產(chǎn)生。通過對病毒感染的單個生活周期的系統(tǒng)性分析,我們發(fā)現(xiàn)病毒離子通道蛋白ns12.9對hcov-oc43病毒感染的侵入、基因組復制、亞基因組信使rna(sgmrnas)的合成以及蛋白合成階段都沒有任何影響,暗示著病毒離子通道蛋白ns12.9可能在hcov-oc43病毒感染的后期階段發(fā)揮作用。隨后通過透射電子顯微鏡成像實驗,我們發(fā)現(xiàn)突變病毒hcov-oc43-Δns12.9在胞內(nèi)病毒組裝過程中受到抑制。相比于野生型病毒hcov-oc43-wt,突變病毒hcov-oc43-Δns12.9胞內(nèi)的病毒粒子數(shù)顯著減少,并表現(xiàn)出一種中空的畸形形態(tài),說明了病毒離子通道蛋白ns12.9參與了hcov-oc43病毒粒子的形態(tài)發(fā)生。此外,小鼠在感染突變病毒hcov-oc43-Δns12.9后的體重下降程度、炎癥反應(yīng)、病毒載量和死亡率都顯著減弱,說明了病毒離子通道蛋白ns12.9與hcov-oc43病毒的毒力相關(guān)。重要的是,通過體外瞬時補償試驗,其他人類冠狀病毒的sne蛋白和其他病毒離子通道蛋白能夠補償突變病毒hcov-oc43-Δns12.9的體外增殖缺陷,證實了人類冠狀病毒的sne蛋白在冠狀病毒感染組裝過程中發(fā)揮著重要的、保守的功能,而且這種功能的發(fā)揮是由其離子通道活性所介導的。綜上所述,我們的研究詳細解析了ns12.9輔助蛋白在hcov-oc43病毒感染過程中的生理功能和分子機制,為深入理解冠狀病毒的感染生活周期和致病機理做出了重大貢獻,為開發(fā)高效抗病毒藥物和減毒疫苗來治療或預防冠狀病毒感染提供了堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
[Abstract]:The coronavirus ( SARS - CoV ) protein is a kind of virus - encoded small molecule hydrophobic protein . It is found that SARS - CoV ' s SNE protein 3a has the function of virus ion channel , and it can be used to regulate the proliferation of SARS - CoV . In this paper , we have shown that hcov - oc43 - 螖ns12 . 9 plays an important role in the process of virus infection . It is important to study the physiological function and molecular mechanism of hcov - oc43 - 螖ns12 .

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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1 張榮華;人類冠狀病毒OC43（HCoV-OC43）輔助蛋白ns12.9的生理功能和分子機制研究[D];蘇州大學;2015年

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本文編號：1375266