本文關(guān)鍵詞：基于RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌新sRNA及探討其致病機(jī)制研究　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 福氏志賀菌 sRNA HFQ 調(diào)控機(jī)制

【摘要】：目前研究表明,sRNA(small regulatory RNAs)在細(xì)菌生命的各個(gè)環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要調(diào)控作用,細(xì)菌10%-30%的基因受sRNA調(diào)控,如sRNA參與了細(xì)菌環(huán)境耐受、質(zhì)粒復(fù)制和細(xì)菌入侵等重要功能調(diào)節(jié)。為此,本文以志賀菌為研究對(duì)象,運(yùn)用RNA-seq技術(shù)開展了新sRNA發(fā)現(xiàn)研究,并探討其可能的致病機(jī)制。志賀菌每年導(dǎo)致全球約1.6億人感染,絕大多數(shù)在發(fā)展國(guó)家,并導(dǎo)致110萬死亡,我國(guó)的志賀菌感染也非常嚴(yán)重,在我國(guó)乙類傳染病發(fā)病率中志賀菌位于第4位,病死率位居第3位,且在我國(guó)以福氏志賀菌流行為主。然而,與大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)100余條sRNA相比,福氏志賀菌僅有2條sRNA被功能注釋,因此,系統(tǒng)開展福氏志賀菌的sRNA識(shí)別和功能研究,闡明sRNA在福氏志賀菌致病過程中的重要生物學(xué)功能和具體的作用機(jī)制,將為進(jìn)一步抗志賀菌感染提供更為深入的理論基礎(chǔ)和可能的藥物新靶標(biāo),對(duì)闡明細(xì)菌的致病機(jī)制和抗細(xì)菌感染研究具有重要意義。RNA-seq技術(shù)不僅可以檢測(cè)基因序列,還可以檢測(cè)它們的表達(dá)水平,同時(shí)可以識(shí)別大量未知轉(zhuǎn)錄本,且具有檢測(cè)準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好和高通量等特點(diǎn),被廣泛用于細(xì)菌sRNA發(fā)現(xiàn)。另外,目前研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌sRNA分子伴侶蛋白HFQ通過與sRNA結(jié)合調(diào)控細(xì)菌的環(huán)境耐受力和毒力等功能。因此,本研究基于RNA-Seq技術(shù),在福氏志賀菌首次開展hfq基因缺失株和野生株轉(zhuǎn)錄譜研究,發(fā)現(xiàn)hfq基因在福氏志賀菌中的功能和調(diào)控機(jī)制。并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在福氏志賀菌中系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了與HFQ蛋白結(jié)合的新sRNA基因,同時(shí),結(jié)合sRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè),開展新發(fā)現(xiàn)sRNA可能致病機(jī)制研究,本文主要包括如下5個(gè)部分:第一部分:利用λ-RED同源重組方法成功構(gòu)建了福氏志賀菌hfq基因突變株,并對(duì)福氏志賀菌開展hfq基因缺失株和野生株轉(zhuǎn)錄譜測(cè)序,獲得了福氏志賀菌野生株301與hfq基因缺失株高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄譜序列,為闡明hfq基因在福氏志賀菌中的功能,以及福氏志賀新sRNA的發(fā)現(xiàn)及其可能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。第二部分:系統(tǒng)分析了野生株301和hfq基因缺失株的高通量測(cè)序數(shù)據(jù),初步發(fā)現(xiàn)了hfq基因的調(diào)控功能,分析結(jié)果顯示,HFQ調(diào)控了福氏志賀菌基因組約16.05%的基因,且大多數(shù)與毒力相關(guān)的基因在hfq基因缺失株中顯著低表達(dá),定量PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,說明HFQ直接或間接的調(diào)控這些毒力因子。同時(shí),T3SS是志賀菌侵入宿主細(xì)胞所必不可少的,然而在hfq基因缺失株中,T3SS相關(guān)的基因及其調(diào)控基因均顯著下調(diào)或者不表達(dá),表明HFQ蛋白參與了T3SS系統(tǒng)的調(diào)控。而部分耐酸基因在缺失株也出現(xiàn)了顯著下調(diào),說明HFQ蛋白也參與了耐酸調(diào)節(jié)。第三部分:通過對(duì)轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的深入分析,發(fā)現(xiàn)了大量位于基因間區(qū)的新轉(zhuǎn)錄本,共獲得了717條新sRNA,而野生株301和hfq基因缺失株之間具有顯著差異的sRNA有280條,這些sRNA可能與HFQ結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用。為了提高發(fā)現(xiàn)新sRNA的準(zhǔn)確性,我們還對(duì)新發(fā)現(xiàn)sRNA開展啟動(dòng)子和終止子預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)共有243條sRNA具有完整轉(zhuǎn)錄單元,我們?nèi)￠L(zhǎng)度大于80bp的92條sRNA用作下一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。第四部分:利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法,對(duì)92條sRNA在不同的生長(zhǎng)階段(6小時(shí)、9小時(shí)和12小時(shí))分別進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,92條sRNA在不同的時(shí)間點(diǎn)全部被檢測(cè)到。同時(shí),我們也對(duì)這92條sRNA開展Nothern雜交檢測(cè),最終發(fā)現(xiàn)10 sRNA有雜交信號(hào),新發(fā)現(xiàn)的10條sRNA分別命名為:sf29、sf46、sf47、sf63、sf69、sf80、sf83、sf86、sf87、sf90。第五部分:我們對(duì)新發(fā)現(xiàn)的10條sRNA開展系統(tǒng)的靶標(biāo)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其可能的作用機(jī)制和通路,發(fā)現(xiàn)sRNA sf46、sf69、sf80可能參與了毒力調(diào)控,其主要的靶標(biāo)是T3SS基因;sRNA sf83參與了適應(yīng)環(huán)境壓力調(diào)控,其調(diào)控通路主要是通過sf83 sRNA與HFQ結(jié)合來調(diào)節(jié)evg S表達(dá),而evg S表達(dá)水平的改變導(dǎo)致耐受環(huán)境蛋白evg A的變化,進(jìn)而影響志賀菌的耐受性;sRNA sf63、sf83、sf87、sf90同時(shí)參與了毒力和環(huán)境耐受調(diào)控,主要是通過調(diào)控T3SS來發(fā)揮致病調(diào)節(jié),而通過調(diào)節(jié)hde B和hde B等耐酸蛋白來進(jìn)行環(huán)境耐受調(diào)控。第一部分構(gòu)建的福氏志賀菌hfq基因突變株,為第二部分獲得野生株和hfq基因缺失株的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)奠定基礎(chǔ),而高通量數(shù)據(jù)的獲得為第三部分研究hfq基因功能及發(fā)現(xiàn)新sRNA提供數(shù)據(jù)支持,第四部分則為預(yù)測(cè)的sRNA候選基因開展系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,第五部分則是對(duì)新發(fā)現(xiàn)的sRNA開展靶標(biāo)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其可能的作用機(jī)制和通路。綜上所述,我們基于RNA-seq技術(shù),首次開展了福氏志賀菌hfq基因缺失株和野生株轉(zhuǎn)錄譜研究,發(fā)現(xiàn)了HFQ蛋白在福氏志賀菌中的功能和調(diào)控機(jī)制,并在福氏志賀菌中系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了10新sRNA及其可能作用通路。該研究為抗志賀菌感染提供了更為深入的理論基礎(chǔ)和可能的藥物新靶標(biāo)。
[Abstract]:In this paper , we have found that the expression of sRNA can be regulated by the RNA - seq technique . In order to improve the accuracy of the new sRNA , we found that there were a number of new transcripts in the gene region . Based on RNA - seq technology , we studied the function and regulation mechanism of hde B and hde B , and found 10 new sRNA and its possible pathways . In conclusion , we provide a deeper theoretical basis and possible new target for anti - Shigella infection .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378

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