本文關(guān)鍵詞：ADH1基因與白念珠菌耐藥性和致病力的相關(guān)性研究　出處：《暨南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：白念珠菌易于感染、難以防治的主要原因在于其致病機(jī)制復(fù)雜且耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。近年來,國內(nèi)外研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些新的基因可能與白念珠菌的致病過程或耐藥機(jī)制相關(guān),因此,深入研究這些基因的具體功能對(duì)進(jìn)一步了解白念珠菌的致病機(jī)理并緩解其耐藥現(xiàn)狀具有重要意義。目的近年來已有零星報(bào)道推測(cè)乙醇脫氫酶I(Alcohol dehydrogenase I,adh1p)的編碼基因ADH1可能與白念珠菌的致病力和耐藥性相關(guān),本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),ADH1基因的表達(dá)產(chǎn)物Adh1p可能參與白念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥,但這些推論迄今尚無直接證據(jù)支持。因此,本課題通過直接敲除白念珠菌ADH1的雙等位基因,旨在直接證實(shí)ADH1基因是否確實(shí)影響菌株自身的致病力及其對(duì)藥物的敏感性,并初步探討其對(duì)線粒體有氧呼吸的影響,為今后臨床上白念珠菌感染的防治及新型抗真菌藥物的開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。方法第一部分:首先采用SAT1-Flipper基因敲除策略構(gòu)建白念珠菌ADH1基因缺失菌和回復(fù)菌,該方法以標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314為親本菌,諾爾斯菌素(nourseothricin,NAT)為篩選標(biāo)記,pSFS2為載體構(gòu)建敲除質(zhì)粒,通過兩輪同源重組分別替代目的基因的兩條等位基因,并以套式PCR的方法進(jìn)行鑒定。隨后進(jìn)行菌株生長動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),將親本菌、基因缺失菌和回復(fù)菌分別等濃度培養(yǎng),在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量各菌株的OD600值,從而繪制各菌株的生長曲線并計(jì)算倍增時(shí)間。第二部分:分別通過酵母菌微量液基稀釋法CLSI M27-A3、M27-S4和瓊脂點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)(Spot assay),觀察并測(cè)定各菌株對(duì)氟康唑(fluconazole,FLC)、伊曲康唑(itraconazole,ITR)、伏立康唑(voriconazole,VRC)、酮康唑(ketoconazole,KCZ)、兩性霉素B(amphotericin B,AmB)和卡泊芬凈(Caspofungin)等抗真菌藥物的最低抑菌濃度(MIC80)和菌落生長情況,以判斷ADH1基因的缺失對(duì)不同機(jī)制抗真菌藥物體外敏感性的影響。第三部分:除藥物敏感性實(shí)驗(yàn)外,本課題同時(shí)通過一系列實(shí)驗(yàn)從不同層面考察ADH1基因缺失對(duì)白念珠菌致病力的影響。(1)菌絲形成實(shí)驗(yàn):分別將各菌株置于四種常用的固體和液體菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Spider、Lee’s、YPD+10%FBS和SLAD)中培養(yǎng),以考察ADH1基因?qū)z形成能力的影響;(2)生物膜形成實(shí)驗(yàn):采用XTT還原法測(cè)定各菌株在RPMI-1640液體培養(yǎng)基中的生物膜形成情況,以考察ADH1基因?qū)ι锬ば纬赡芰Φ挠绊?(3)體外粘附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞表面疏水性實(shí)驗(yàn):分別將各菌株置于Spider和YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),以考察ADH1基因?qū)Π啄钪榫?xì)胞的粘附能力和相對(duì)疏水性的影響;(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time RT PCR)實(shí)驗(yàn):考察并分析目的基因敲除前后菌絲和粘附特異性相關(guān)基因ALS1、ALS3、HWP1和CSH1 mRNA水平的表達(dá)情況;(5)體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn):分別以小鼠,秀麗隱桿線蟲和蠟螟模型作為體內(nèi)感染模型,考察ADH1基因在不同的體內(nèi)環(huán)境中對(duì)菌株致病力的影響。第四部分:分別通過不同的熒光染料試劑盒檢測(cè)ADH1基因缺失后白念珠菌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平、ATP含量和內(nèi)源性活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的變化,初步考察ADH1基因?qū)�粒體有氧呼吸的影響。結(jié)果第一部分:采用SAT1-Flipper基因敲除策略首先成功構(gòu)建了白念珠菌ADH1基因缺失菌ADH1M2B(adh1Δ/Δ)和回復(fù)菌ADH1ReB(adh1Δ/ADH1)。生長動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,與SC5314和ADH1ReB相比,ADH1M2B在對(duì)數(shù)生長期的的倍增時(shí)間差異不大,且SC5314和ADH1ReB的生長無明顯差異,說明ADH1基因敲除后并沒有顯著限制菌株的生長。第二部分:微量液基稀釋法和Spot assay實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1M2B對(duì)多種唑類抗真菌藥物FLC、ITR、KCZ和VRC,多烯類抗真菌藥物AmB和丙烯胺類抗真菌藥物卡泊芬凈的MIC80表現(xiàn)為無變化或僅降低一個(gè)濃度梯度,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且菌落生長狀態(tài)基本無差異,說明ADH1基因缺失后,菌株對(duì)上述多種抗真菌藥物的敏感性基本無影響。第三部分:菌絲形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與SC5314比較,ADH1M2B在四種液體或固體菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的菌絲形成能力均顯著減弱,在液體培養(yǎng)基中只能形成芽孢或很短的假菌絲且在固體培養(yǎng)基中形成的菌落邊緣光滑無放射性菌絲,而當(dāng)ADH1基因回復(fù)時(shí),菌絲的形成能力也得以回復(fù),說明ADH1基因可能是影響白念珠菌菌絲形成的關(guān)鍵基因;生物膜形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與SC5314比較,ADH1M2B在RPMI-1640液體培養(yǎng)基中生物膜形成能力顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而ADH1ReB與SC5314的生物膜形成能力相似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,由此說明,ADH1基因?qū)Π啄钪榫锬ば纬善鹬匾饔?體外粘附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞表面疏水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1M2B在體外的粘附能力和細(xì)胞表面相對(duì)疏水性菌顯著減弱,說明ADH1基因可顯著影響白念珠菌細(xì)胞的粘附能力和細(xì)胞表面相對(duì)疏水性;Real-Time RT PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1基因敲除后菌株內(nèi)重要致病力相關(guān)基因ALS1,ALS3,HWP1和CSH1的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào),進(jìn)一步證實(shí)ADH1基因與菌絲形成和粘附相關(guān);體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1基因缺失后,小鼠、秀麗隱桿線蟲和蠟螟的生存時(shí)間均明顯延長,且小鼠的臟器組織負(fù)荷菌量顯著減少,腎臟病理損傷明顯減弱,說明ADH1基因可顯著降低白念珠菌體內(nèi)模型的致病力。第四部分:線粒體能量代謝相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí),作為白念珠菌無氧酵解關(guān)鍵酶乙醇脫氫酶Ⅰ的編碼基因,ADH1缺失對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體有氧氧化有顯著影響,具體表現(xiàn)為線粒體膜電位水平和ATP含量均顯著降低,內(nèi)源性活性氧(ROS)水平顯著升高。結(jié)論本課題通過直接敲除白念珠菌ADH1的雙等位基因,并進(jìn)行一系列表型研究,發(fā)現(xiàn)該基因缺失后對(duì)多種常見抗真菌藥物的敏感性無明顯影響,但可顯著減弱白念珠菌在體內(nèi)和體外的致病力,并證實(shí)致病力變化與菌株生長動(dòng)力無關(guān),同時(shí),本實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)作為無氧酵解關(guān)鍵酶的編碼基因,ADH1缺失對(duì)菌株線粒體有氧呼吸有明顯影響,為下一步深入研究其對(duì)致病力影響的作用機(jī)制是否與線粒體有氧呼吸相關(guān)提供新的思路和線索。
[Abstract]:In recent years , it has been found that the gene ADH1 of the ADH1 gene may be involved in the pathogenesis of Candida albicans and its resistance to drug resistance . In order to determine the effect of the deletion of ADH1 gene on the in vitro susceptibility to antifungal drugs of different mechanisms , the third part : In addition to the drug sensitivity experiment , the effect of ADH1 gene deletion on the pathogenicity of Candida albicans was investigated from different levels through a series of experiments . ( 1 ) The effect of ADH1 gene on the formation ability of Candida albicans was investigated by means of XTT reduction method . The results showed that ADH1 gene had a significant effect on the formation and adhesion of Candida albicans . The results showed that the ADH1 gene had a significant effect on the formation and adhesion of Candida albicans . The results showed that ADH1 gene could significantly decrease the adhesion ability of Candida albicans and the relative hydrophobicity of cell surface . The results showed that the change of pathogenicity was not related to the growth kinetics of the strain . At the same time , it was found that the deletion of ADH1 was a key enzyme in anaerobic yeast . The deletion of ADH1 had a significant effect on the mitochondrial aerobic respiration of the strain , and it was possible to provide a new idea and clue for the next study on whether the mechanism of the effect of ADH1 was related to mitochondrial aerobic respiration .

【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R379.4

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本文編號(hào)：1371699