發(fā)布時(shí)間：2018-01-02 19:31

  本文關(guān)鍵詞：利用大鼠模型定位先天性巨結(jié)腸癥及色素異常相關(guān)易感基因的研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：神經(jīng)嵴是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育早期短暫存在的一個(gè)結(jié)構(gòu),神經(jīng)嵴細(xì)胞經(jīng)遷移、增殖和分化等過(guò)程可發(fā)育成多種不同組織細(xì)胞,其中包括腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和色素細(xì)胞。神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、增殖和分化過(guò)程復(fù)雜,受多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控,涉及多個(gè)基因。這些調(diào)控基因發(fā)生結(jié)構(gòu)變異或表達(dá)量的變化均可導(dǎo)致神經(jīng)嵴細(xì)胞來(lái)源的腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和色素細(xì)胞發(fā)育障礙,引發(fā)先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung’s disease,HSCR)和皮毛顏色異常。HSCR又稱無(wú)神經(jīng)節(jié)性巨結(jié)腸(aganglionic megacolon),是一種可遺傳的、人獸共有的腸道發(fā)育異常,病因是胚胎發(fā)育早期神經(jīng)嵴細(xì)胞分化移行障礙導(dǎo)致腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺損,受累腸道節(jié)律性收縮蠕動(dòng)功能異常,腸內(nèi)容物排出受阻,近端腸管繼發(fā)性擴(kuò)張形成。HSCR病因復(fù)雜,表型多變,多為散發(fā),不遵守孟德?tīng)栠z傳定律,被認(rèn)為是多基因互作的結(jié)果。已有的研究結(jié)果只能解釋部分病例。因此,探尋HSCR未知易感基因和修飾位點(diǎn)或修飾基因具有重要意義。動(dòng)物皮毛的顏色由神經(jīng)嵴細(xì)胞來(lái)源的、黑色素細(xì)胞分泌的黑色素種類和數(shù)量共同決定。黑色素細(xì)胞發(fā)育異常不但會(huì)引起機(jī)體皮毛顏色異常,還被認(rèn)為與多種人類疾病相關(guān),如惡性黑色素瘤、帕金森病等。黑色素細(xì)胞發(fā)育過(guò)程復(fù)雜,受多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,但相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍未完全研究清楚。本研究以表型嚴(yán)重程度不同的AGH和LEH兩個(gè)品系的HSCR大鼠模型為親本產(chǎn)生F1代,再互交制作F2代群體,在F2代進(jìn)行HSCR和色素異常相關(guān)QTL定位,進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析方法在其置信區(qū)間內(nèi)篩選可能的HSCR和色素異常相關(guān)基因,通過(guò)對(duì)候選基因進(jìn)行測(cè)序分析來(lái)尋找在兩個(gè)大鼠品系中存在的遺傳差異,通過(guò)載體構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)相關(guān)遺傳差異進(jìn)行功能性分析,進(jìn)一步研究其修飾HSCR表型的機(jī)理。為進(jìn)一步鑒定兩個(gè)基因的互作修飾HSCR表型和色素異常表型,本研究還進(jìn)行了基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建和電穿孔法將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9的mRNA和g RNA的RNA導(dǎo)入小鼠胚胎制作基因敲除小鼠的初步探究。本研究主要得到以下結(jié)果:(1)AGH-Ednrbsl/sl大鼠腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺損嚴(yán)重,LEH-Ednrbsl/sl個(gè)體癥狀較輕,F1-Ednrbsl/sl個(gè)體腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失程度較AGH-Ednrbsl/sl個(gè)體得到緩解,說(shuō)明在LEH遺傳背景中存在與Ednrb互作共同影響腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的修飾基因或修飾位點(diǎn)。(2)在大鼠2號(hào)染色體(Chromosome,Chr)上定位到一個(gè)與HSCR顯著相關(guān)的qtl位點(diǎn),最高lrs值(d2mgh14)達(dá)25.0,該位點(diǎn)造成的變異占總變異的15%。對(duì)于該位點(diǎn),leh等位基因?qū)scr表型表現(xiàn)為抵抗作用,agh純合個(gè)體hscr癥狀最嚴(yán)重,leh純合個(gè)體hscr癥狀最輕,agh/leh雜合個(gè)體hscr癥狀則介于兩者之間。(3)在chr2上的hscr相關(guān)qtl位點(diǎn)的置信區(qū)間內(nèi)篩選出三個(gè)hscr相關(guān)候選基因:slc45a2、gdnf和ptger4。測(cè)序發(fā)現(xiàn)gdnf基因第一起始密碼子上游第613位堿基處存在c/t突變(g.76896910ct),其中,leh群體為c,agh群體為t。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)使agh大鼠gdnf基因啟動(dòng)子活性明顯降低。提示agh與leh品系間ednrbsl/sl大鼠腸神經(jīng)節(jié)缺損型存在差異可能歸因于gdnf基因與ednrb基因的互作。(4)agh-ednrbsl/sl大鼠毛色幾乎全白,leh-ednrbsl/sl大鼠頭部有較大一塊著色,f1代中ednrbsl/sl個(gè)體色素異常癥狀得到緩解,說(shuō)明在leh遺傳背景中存在與ednrb互作共同影響黑色素細(xì)胞發(fā)育的修飾位點(diǎn)或修飾基因。(5)在大鼠chr7上定位到一個(gè)與色素異常極顯著相關(guān)的qtl位點(diǎn),最高lrs值(d7got23)為45.0,該位點(diǎn)造成的變異占總變異的26%,agh純合個(gè)體色素異常程度最嚴(yán)重,leh純合個(gè)體色素異常程度與agh/leh雜合個(gè)體色素異常嚴(yán)重程度相當(dāng)。另外,d7got23位點(diǎn)分別與d14mit4位點(diǎn)及d3rat78位點(diǎn)存在互作效應(yīng),共同修飾色素異常表型。其中,在d7got23位點(diǎn)與d3rat78位點(diǎn)上,均是leh等位基因?qū)ι禺惓４嬖诘挚棺饔?而在d14mit4位點(diǎn)上是agh基因型對(duì)色素異常存在抵抗作用。(6)在大鼠chr7色素異常相關(guān)qtl位點(diǎn)的置信區(qū)間內(nèi)篩選得到3個(gè)色素異常相關(guān)候選基因:lgr5、wif1和kitlg基因。同線性分析發(fā)現(xiàn)該qtl位點(diǎn)與小鼠chr10上一個(gè)色素異常相關(guān)的qtl位點(diǎn)同源,并且發(fā)現(xiàn)已知的毛色異常易感基因kitlg基因位于該區(qū)域。在agh和leh品系的lgr5和wif1基因外顯子區(qū)及上游部分啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)差異;而在kitlg基因編碼區(qū)檢測(cè)到一個(gè)錯(cuò)義突變(g.42338824ct),該突變?cè)斐蓪?duì)應(yīng)氨基酸由脯氨酸變成絲氨酸。在線軟件sitf預(yù)測(cè)該突變可能影響其蛋白質(zhì)功能。結(jié)果提示agh-ednrbsl/sl大鼠與leh-ednrbsl/sl大鼠毛色表型的差異可能歸因于kitlg基因與ednrb基因互作。(7)基于crispr/cas9基因編輯技術(shù),分別設(shè)計(jì)并驗(yàn)證得到用于敲除大鼠/小鼠ednrb基因和gdnf基因的grna,分別為:1)rat-ednrb-grna:gagccggtgcggacg-cgcct;2)rat-gdnf-grna:cgcttcgagaagcgtcttac;3)mouse-ednrb-grna:gagccggtgcggacgcgcct;4)mouse-gdnf-grna:gtctacggagaccggat-ccg。并篩選得到大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系ednrb基因敲除單克隆細(xì)胞株和gdnf基因敲除單克隆細(xì)胞株。為后期從細(xì)胞水平上研究ednrb(gdnf)基因突變對(duì)gdnf(ednrb)基因及其它腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響及制作ednrb和gdnf基因敲除小鼠奠定基礎(chǔ)。(8)體外轉(zhuǎn)錄得到crispr/cas9系統(tǒng)組件及egfpmrna。在體外用電穿孔法將羅丹明導(dǎo)入1.5 d小鼠胚胎時(shí),摸索到的最佳條件為:電壓110 v,脈沖時(shí)間5 ms,脈沖間隔為50 ms,脈沖次數(shù)為3。此時(shí),正常發(fā)育且成功電轉(zhuǎn)羅丹明效率可達(dá)27%。電壓過(guò)高或過(guò)低電轉(zhuǎn)效率均急劇下降。這些結(jié)果為后期利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制作基因敲除鼠以研究Gdnf與Ednrb基因、Kitlg與Ednrb基因互作影響腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和黑色素細(xì)胞發(fā)育的遺傳機(jī)制奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to further identify the genetic differences between the two genes , it is suggested that the development of HSCR may lead to the development of neural crest cells , such as malignant melanoma , Parkinson ' s disease and so on . ( 3 ) There was a significant difference in the expression of the gdnf gene in the rat intestine . ( 8 ) To study the effect of ednrb ( gdnf ) gene mutation on gdnf ( ednrb ) gene and other intestinal ganglion cell development - related gene expression in vitro .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R722.1;R-332
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本文編號(hào)：1370643