本文關(guān)鍵詞：內(nèi)蒙古EV71病毒C008株抗VP1血清的制備與中和效果的測(cè)定　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：腸道病毒 71 型(Enterovirus71,EV71),屬于小 RNA 病毒科(Picornavirus)腸道病毒屬(Enterovirus),是一直徑大約30 nm的二十面體立體對(duì)稱(chēng)的小球型結(jié)構(gòu),無(wú)包膜和突起,由外層衣殼和RNA核心構(gòu)成。近十年間EV71成為亞太地區(qū)手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原體。而且感染EV71病毒后有可能出現(xiàn)高燒、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、肺水腫和致死性腦炎。現(xiàn)今針對(duì)EV71感染沒(méi)有有效治療藥物,預(yù)防所用的滅活疫苗是否可達(dá)到預(yù)期的效果還有待觀察。同時(shí)EV71病毒分型眾多,不同地區(qū)發(fā)生EV71感染往往呈不同流行特點(diǎn)。了解內(nèi)蒙古本地EV71病毒的分型和作為抗原的性質(zhì),有助于進(jìn)一步研究更安全有效的疫苗。EV71病毒衣殼顆粒由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4組成,包圍著約7.4kb的單股正鏈RNA。除了 VP4包埋在病毒粒子的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接外,其他三種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒表面,因此這三種蛋白擁有EV71病毒主要的抗原決定簇。據(jù)研究,KP1基因的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)區(qū)易于變異,這種變異提供了病毒遺傳多樣性,也成為病毒分型的主要依據(jù)。并且,VP1蛋白上的抗原決定簇是病毒抗原性的決定因子,抗體中和反應(yīng)的抗原表位多集中于此。因此在研究EV71病毒的時(shí)候,VP1蛋白的研究成為主要的研究方向,有望成為重組蛋白疫苗。為了深入了解內(nèi)蒙古本地EV71病毒的基因分型和制備針對(duì)EV71病毒VP1蛋白的抗體及重組疫苗,本實(shí)驗(yàn)提取EV71病毒的總RNA,根據(jù)GenBank中儲(chǔ)存的EV71病毒VP1蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物,用一步法RT-PCR得到VP1 cDNA約為891bp。將得到的PCR產(chǎn)物與pET3a載體連接,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-VP1。再通過(guò)設(shè)計(jì)含有HIS標(biāo)簽的引物以pET-VP1載體為模板進(jìn)行PCR,得到了上游帶有HIS標(biāo)簽的VP1 cDNA序列約為909 bp。PCR產(chǎn)物與pET3a連接得到第二種重組表達(dá)載體pET-HIS-VP1。將兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌體中高效表達(dá),獲得了 VP1蛋白和HIS-VP1重組蛋白,SDS-PAGE鑒定蛋白大小約37kDa。用純化的VP1蛋白和HIS-VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗VP1血清。同時(shí)用EV71病毒免疫BALB/c小鼠,同樣得到了抗EV71病毒的血清。使用上述3種血清進(jìn)行Western Blot和病毒中和實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其保護(hù)作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三種血清都對(duì)VP1蛋白和HIS-VP1蛋白有特異性,中和實(shí)驗(yàn)表明抗VP1蛋白血清和抗HIS-VP1蛋白血清均可在1:65 536稀釋度時(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用,二者無(wú)顯著差異,而對(duì)照組抗完整病毒的血清在1:81 920稀釋度時(shí),對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。抗VP1蛋白血清的中和病毒能力雖然不如抗完整病毒的血清,但效果非常明顯。鑒于原核表達(dá)帶HIS標(biāo)簽的VP1蛋白安全,可大量制備,容易純化,有望成為腸道病毒71型的基因工程疫苗。
[Abstract]:EV71 virus ( EV71 ) is a main pathogen of human foot and mouth disease ( HFMD ) . Western Blot showed that three kinds of serum were specific for VP1 protein and HIS - VP1 protein . The results showed that anti - VP1 protein serum and anti - HIS - VP1 protein could protect the cells at 1 鈭，

本文編號(hào)：1365532