本文關(guān)鍵詞：殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞靶向殺傷抗原特異性T細(xì)胞及抑制皮膚移植排斥的研究　出處：《東南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞 聚乳酸-羥基乙酸 同種異體皮膚移植 同種反應(yīng)性T細(xì)胞 特異性免疫療法

【摘要】：系統(tǒng)性使用大劑量免疫抑制藥物治療移植排斥導(dǎo)致的眾多副作用,促使了針對(duì)移植排斥的特異性免疫療法的發(fā)展。選擇性清除或抑制同種反應(yīng)性T細(xì)胞是治療移植排斥的理想策略之一。因此,近十余年來(lái),非細(xì)胞性的、以抗原肽/主要組織相容性抗原(peptide/major histocompatibility complex, p/MHC)為靶向的,針對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的特異性殺傷制劑被廣泛研究。最新的進(jìn)展之一是在非細(xì)胞性載體表面包被pMHC多聚體和Fas配體,制備殺傷性人工抗原遞呈細(xì)胞(Killer artificial antigen-presenting cells, KaAPCs)。其中以磁珠或膠乳微球?yàn)檩d體的KaAPCs已經(jīng)被報(bào)道能在體外選擇性殺傷抗原特異性T細(xì)胞。然而,此類載體不易在體內(nèi)生物降解,缺乏生物相容性,且在體內(nèi)和器官移植模型中的研究鮮有報(bào)道。本研究是以可生物降解的聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)微球(Microparticles, MPs)作為載體,在其表面共包被H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗,制備成基于PLGA的KaAPCs。其表面的H-2Kb-Ig二聚體可以裝載特定的抗原肽,形成p/MHC復(fù)合體,從而與抗原特異性T細(xì)胞的TCR靶向結(jié)合,同時(shí)其表面的anti-Fas單抗能夠誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞凋亡,達(dá)到靶向殺傷抗原特異性T細(xì)胞的目的。在同種異體移植模型中,KaAPCs表面的H-2Kb-Ig二聚體即作為同種抗原,與受者鼠體內(nèi)H-2Kb同種抗原反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的TCR特異性結(jié)合,并利用anti-Fas單抗誘導(dǎo)活化的同種反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡,實(shí)現(xiàn)對(duì)移植排斥的特異性免疫治療。研究目的：以O(shè)T-1轉(zhuǎn)基因小鼠為模型研究KaAPCs能否在體外和其體內(nèi)選擇性清除OVA257-264抗原特異性T細(xì)胞；并以小鼠同利,異體皮膚移植為模型,分析KaAPCs特異性殺傷同種反應(yīng)性T細(xì)胞的能力和治療移植排斥的效果,進(jìn)而探討其在體內(nèi)的作用機(jī)制。研究方法及結(jié)果：1、PLGA MPs的制備及表征：以PLGA聚合物為原材料,采用乳化溶劑揮發(fā)法制備直徑約為5μm的PLGA MPs,并利用化學(xué)修飾法使其表面功能化(帶有NH2+)；通過(guò)掃描電鏡(Scanning Electronic Microscopy,SEM)、粒徑分析儀和Zeta電位分析儀對(duì)PLGA MPs進(jìn)行表征,并通過(guò)蛋白定量和流式技術(shù)分析其吸附蛋白的能力。結(jié)果顯示：PLGA MPs在SEM下呈現(xiàn)良好的球形,粒徑分布在1-10gmn,且80%的MPs集中在5-6μm,平均Zeta電位為65.2±6.7 mV,表明其帶有足夠電荷,2×107MPs對(duì)BSA的最大吸附量為80μg。以上結(jié)果表明自制的PLGA MPs具有良好的表征。2、KaAPCs的制備及其表型分析：把PLGA MPs和H-2Kb-Ig二聚體以及anti-Fas單抗共孵育后,制備成KaAPCs,并經(jīng)特異性熒光單抗染色、流式細(xì)胞技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)驗(yàn)證KaAPCs表型。結(jié)果顯示,H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗被成功共包被到PLGA MPs表面,表明所制的KaAPCs具有良好的表型。3、KaAPCs靶向殺傷OVA257-264抗原特異性T細(xì)胞：在體外,把裝載OVA257-264的KaAPCs (Kb/OVA-KaAPC)與OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠(其CD8+T細(xì)胞TCR以H-2Kb限制的方式識(shí)別OVA257-264)的脾細(xì)胞共孵育24小時(shí),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞群中CD8+T細(xì)胞的凋亡比例以及OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量比例。結(jié)果顯示Kb/OVA-KaAPC能夠誘導(dǎo)大約80%的CD8+T細(xì)胞凋亡,OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞比例顯著下降83%左右。而無(wú)關(guān)抗原肽對(duì)照組沒有出現(xiàn)明顯凋亡,OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞沒有明顯減少,表明KaAPCs能夠在體外特異性地殺傷抗原特異性CD8+T細(xì)胞。其中anti-Fas介導(dǎo)的凋亡為主,活化誘導(dǎo)的凋亡(AICD)極少。在體內(nèi),Kb/OVA-KaAPC經(jīng)尾靜脈注入OT-1鼠后,在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析其外周血中CD8+T細(xì)胞的凋亡比例及OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量比例。結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)相似,CD8+T細(xì)胞凋亡比例最高達(dá)75%左右,OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞的比例最高下降大約84%,而對(duì)照組無(wú)顯著變化。KaAPC的殺傷效率與其劑量、作用時(shí)間呈正相關(guān)。這表明KaAPC在體內(nèi)也能靶向殺傷抗原特異性的CD8+T細(xì)胞。4、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的有效方案的研究：以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為供受體,建立同種異體皮膚移植模型。KaAPCs(包被自制H-2Kb單體和商品化anti-Fas單抗)經(jīng)尾靜脈或局部注入受者鼠后,觀察移植皮塊的生存狀況,進(jìn)行臨床評(píng)分,并通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)移植皮塊中CD8+T和CD4+T細(xì)胞的浸潤(rùn)量,同時(shí)多指標(biāo)監(jiān)測(cè)受者鼠的整體免疫功能。結(jié)果：比較多種方案的效果后,明確了靶向抗原和anti-Fas的包被劑量、KaAPCs的注射途徑、劑量、次數(shù)和時(shí)間點(diǎn)等治療措施。據(jù)此,KaAPCs能顯著延長(zhǎng)移植皮塊的生存時(shí)間達(dá)4-6天,并明顯減少移植皮塊中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量,對(duì)CD4+T細(xì)胞無(wú)明顯影響,且不明顯抑制受者鼠的整體免疫功能。5、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的優(yōu)化方案及其機(jī)制研究：以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bml鼠(H-2Kbml)為供受體,建立同種異體皮膚移植模型。在優(yōu)化方案下,經(jīng)三次尾靜脈注射KaAPCs(包被商品化H-2Kb-Ig二聚體和商品化anti-Fas)治療受者鼠后,觀察移植皮塊的生存狀況和排斥程度；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)受者鼠外周血和脾臟中T細(xì)胞的凋亡比例及H-2Kb同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞比例；免疫組化分析移植皮塊中浸潤(rùn)的CD8+ T、CD4+T細(xì)胞和H-2Kb同種反應(yīng)性T細(xì)胞的量；針對(duì)供體的同種增殖能力檢測(cè)；脾臟及淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)；KaAPCs對(duì)受者鼠脾臟中B、NK、 T細(xì)胞以及外周血中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群等的影響；通過(guò)抗腫瘤能力、T細(xì)胞庫(kù)針對(duì)第三方抗原的同種增殖能力和NK細(xì)胞殺瘤能力的分析,監(jiān)測(cè)KaAPCs對(duì)受者鼠整體免疫功能的影響；觀察KaAPCs在體內(nèi)的運(yùn)行和分布。結(jié)果顯示：三次尾靜脈輸注后KaAPCs能經(jīng)血流進(jìn)入淋巴結(jié)和脾臟,并與CD8+T細(xì)胞直接接觸,有效地靶向殺傷外周血和脾臟中同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞,殺傷率達(dá)82%左右,從而大幅減少了同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞在移植皮塊中的浸潤(rùn),同時(shí)上調(diào)了淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平,最終延長(zhǎng)移植皮塊的存活時(shí)間達(dá)42.5天,且對(duì)受者鼠體內(nèi)的其他免疫細(xì)胞群沒有明顯影響,也沒有顯著損傷受者鼠的整體免疫功能。結(jié)論：基于PLGA微球的KaAPCs能夠在體外和體內(nèi)選擇性殺傷抗原特異性CD8+T細(xì)胞,且能在不損傷受者鼠整體免疫功能的情況下,通過(guò)靶向殺傷同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞而有效抑制同種皮膚移植排斥反應(yīng),顯著延長(zhǎng)皮膚移植物的存活期。提示KaAPCs可以作為治療移植排斥或自身免疫病的新型特異性免疫治療策略。
[Abstract]:Systematic use of large dose immunosuppressive drugs for the treatment of many side effects caused by graft rejection has contributed to the development of specific immunotherapy for transplant rejection . The selective removal or inhibition of alloreactive T cells is one of the ideal strategies for the treatment of transplant rejection . One of the most recent developments is the inclusion of pMHC multimers and Fas ligands on the surface of non - cellular carriers to prepare killer artificial antigen - presenting cells , Kaolinones . In vivo and in vivo , the H - 2Kb - Ig dimer ( PLGA ) microspheres were used as a carrier to study the specific cytotoxic T - cells in vitro and in vivo . The percentage of CD8 + T cells in peripheral blood and the percentage of OVA257 - 264 specific CD8 + T cells were investigated by flow cytometry . The percentage of T cells in peripheral blood and spleen of recipient mice and the ratio of H - 2Kb alloreactive CD8 + T cells were detected by flow cytometry . The effects of activated CD8 + T , CD4 + T cells and H - 2Kb alloreactive T cells were detected by immunohistochemistry .

【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳軍;一種細(xì)胞接觸性抗原特異性抑制信號(hào)[J];重慶醫(yī)學(xué);2002年08期

2 孫立英;郭胤仕;;抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增方法及應(yīng)用前景[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2010年03期

3 McFarlane G;鄭培君;;人類肝臟的抗原[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));1981年03期

4 谷口克;張永祥;;抗原特異性抑制性T細(xì)胞因子的功能和分子結(jié)構(gòu)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)情報(bào);1981年03期

5 千葉丈 ,楊吉明;抗原特異性T細(xì)胞的克隆法[J];微生物學(xué)免疫學(xué)譯刊;1983年04期

6 田強(qiáng);�？乖禺愋訲細(xì)胞系的產(chǎn)生及特性[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));1991年03期

7 Byron Ballou,楊曉峰;適于體內(nèi)攻擊腫瘤的抗原特異性選擇[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1988年01期

8 陳躍;許戈良;王保龍;;抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增及其功能測(cè)定[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年04期

9 苑淑賢;任科研;楊金生;董冬梅;姚新華;;旋毛蟲排泄-分泌抗原的制備及在免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用研究[J];農(nóng)業(yè)與技術(shù);2006年04期

10 孟濟(jì)明;鄒和建;葉霜;;名正而言順,本立而道生——關(guān)于抗原定義的討論[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2008年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 仲人前;劉海英;;原發(fā)性膽汁性肝硬化中抗原特異性CTL功能分析[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

2 席泓;朱一蓓;古濤;李文新;顧宗江;李文香;張學(xué)光;;體外活化擴(kuò)增腫瘤抗原特異性CTL優(yōu)化方案的研究[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

3 何賢輝;查慶兵;徐麗慧;賈仟濤;李豐耀;;健康青年中國(guó)人中HCMV特異性記憶CD8~+ T細(xì)胞頻率和表型分析[A];第三屆全國(guó)中醫(yī)藥免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2006年

4 孫偉;唐婕;吳雄文;李佳楠;陸盛軍;陳雪玲;翁秀芳;梁智輝;;原位四聚體染色法檢測(cè)冰凍切片中的抗原特異性CTLs[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

5 任科研;苑淑賢;楊金生;都業(yè)文;姚新華;;旋毛蟲排泄—分泌抗原的制備與分析[A];吉林省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2007學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2007年

6 趙長(zhǎng)霖;李兵;楊培增;;Behcet病患者S-抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

7 苑淑賢;任科研;楊金生;董冬梅;姚新華;;豬旋毛蟲排泄-分泌抗原的制備及在Dot-ELISA中的應(yīng)用研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

8 許文;鐘昭炎;袁志宏;洪超;高曉明;;抗活化態(tài)T細(xì)胞自身抗體的抗原特異性及功能研究[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

9 徐曉軍;湯永民;沈紅強(qiáng);錢柏芹;;新的T細(xì)胞活化標(biāo)志ZCH-2B8a抗原的分子特性及功能研究[A];2009年浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2009年

10 王靖雪;;Lewis X寡糖靶向DC-SIGN增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王偉;殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞靶向殺傷抗原特異性T細(xì)胞及抑制皮膚移植排斥的研究[D];東南大學(xué);2016年

2 喬苗;抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表型分析的新方法[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2001年

3 蔣靜;結(jié)核病患者結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

4 劉海英;原發(fā)性膽汁性肝硬化患者中抗原特異性T細(xì)胞的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

5 楊新星;HBV感染者中抗原特異性CTL免疫應(yīng)答狀況的研究[D];華中科技大學(xué);2009年

6 陸盛軍;中國(guó)人群常見HLA-A2亞型間抗原特異性差異的實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2009年

7 孫亞民;克羅諾桿菌屬O抗原分型系統(tǒng)的建立及多樣性形成機(jī)制研究[D];南開大學(xué);2012年

8 黃莉莉;HSV-1特異轉(zhuǎn)移因子的抗原依賴活性及其化學(xué)本質(zhì)的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1986年

9 張夢(mèng)軍;CD4~+Foxp3~+ Tregs在慢性HBV感染中的作用及其抗原特異性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

10 姜廷帥;不同來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在小鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郝廣萍;不同抗原在小鼠脾臟和胸腺內(nèi)誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)[D];山東大學(xué);2015年

2 馬奔;供體來(lái)源ImDex聯(lián)合供體抗原特異性Treg保護(hù)大鼠肝臟移植物的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 吳優(yōu);磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的研制及抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和反應(yīng)活性的檢測(cè)[D];東南大學(xué);2015年

4 曹國(guó)番;同種異基因抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體外擴(kuò)增[D];華東師范大學(xué);2012年

5 王永磊;抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

6 吳靜;轉(zhuǎn)基因表達(dá)乙型肝炎病毒抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞受體的研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2013年

7 王瓊;旋毛蟲成蟲蟲體抗原、排泄分泌抗原和表面抗原保護(hù)性免疫的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2003年

8 牛翰婕;結(jié)核抗原特異性CD4~+中央型記憶T細(xì)胞的檢測(cè)及分布特性的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

9 李健;供體抗原特異性CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)大鼠移植腎慢性排斥反應(yīng)作用效應(yīng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 張淦;輸注兩種抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞延長(zhǎng)NOD小鼠同種胰島移植物的存活時(shí)間[D];華中科技大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：1361087