本文關(guān)鍵詞：殺傷性人工抗原提呈細胞靶向殺傷抗原特異性T細胞及抑制皮膚移植排斥的研究　出處：《東南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：系統(tǒng)性使用大劑量免疫抑制藥物治療移植排斥導(dǎo)致的眾多副作用,促使了針對移植排斥的特異性免疫療法的發(fā)展。選擇性清除或抑制同種反應(yīng)性T細胞是治療移植排斥的理想策略之一。因此,近十余年來,非細胞性的、以抗原肽/主要組織相容性抗原(peptide/major histocompatibility complex, p/MHC)為靶向的,針對抗原特異性T細胞的特異性殺傷制劑被廣泛研究。最新的進展之一是在非細胞性載體表面包被pMHC多聚體和Fas配體,制備殺傷性人工抗原遞呈細胞(Killer artificial antigen-presenting cells, KaAPCs)。其中以磁珠或膠乳微球為載體的KaAPCs已經(jīng)被報道能在體外選擇性殺傷抗原特異性T細胞。然而,此類載體不易在體內(nèi)生物降解,缺乏生物相容性,且在體內(nèi)和器官移植模型中的研究鮮有報道。本研究是以可生物降解的聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)微球(Microparticles, MPs)作為載體,在其表面共包被H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗,制備成基于PLGA的KaAPCs。其表面的H-2Kb-Ig二聚體可以裝載特定的抗原肽,形成p/MHC復(fù)合體,從而與抗原特異性T細胞的TCR靶向結(jié)合,同時其表面的anti-Fas單抗能夠誘導(dǎo)抗原特異性T細胞凋亡,達到靶向殺傷抗原特異性T細胞的目的。在同種異體移植模型中,KaAPCs表面的H-2Kb-Ig二聚體即作為同種抗原,與受者鼠體內(nèi)H-2Kb同種抗原反應(yīng)性CD8+T細胞的TCR特異性結(jié)合,并利用anti-Fas單抗誘導(dǎo)活化的同種反應(yīng)性T細胞凋亡,實現(xiàn)對移植排斥的特異性免疫治療。研究目的：以O(shè)T-1轉(zhuǎn)基因小鼠為模型研究KaAPCs能否在體外和其體內(nèi)選擇性清除OVA257-264抗原特異性T細胞；并以小鼠同利,異體皮膚移植為模型,分析KaAPCs特異性殺傷同種反應(yīng)性T細胞的能力和治療移植排斥的效果,進而探討其在體內(nèi)的作用機制。研究方法及結(jié)果：1、PLGA MPs的制備及表征：以PLGA聚合物為原材料,采用乳化溶劑揮發(fā)法制備直徑約為5μm的PLGA MPs,并利用化學(xué)修飾法使其表面功能化(帶有NH2+)；通過掃描電鏡(Scanning Electronic Microscopy,SEM)、粒徑分析儀和Zeta電位分析儀對PLGA MPs進行表征,并通過蛋白定量和流式技術(shù)分析其吸附蛋白的能力。結(jié)果顯示：PLGA MPs在SEM下呈現(xiàn)良好的球形,粒徑分布在1-10gmn,且80%的MPs集中在5-6μm,平均Zeta電位為65.2±6.7 mV,表明其帶有足夠電荷,2×107MPs對BSA的最大吸附量為80μg。以上結(jié)果表明自制的PLGA MPs具有良好的表征。2、KaAPCs的制備及其表型分析：把PLGA MPs和H-2Kb-Ig二聚體以及anti-Fas單抗共孵育后,制備成KaAPCs,并經(jīng)特異性熒光單抗染色、流式細胞技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)驗證KaAPCs表型。結(jié)果顯示,H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗被成功共包被到PLGA MPs表面,表明所制的KaAPCs具有良好的表型。3、KaAPCs靶向殺傷OVA257-264抗原特異性T細胞：在體外,把裝載OVA257-264的KaAPCs (Kb/OVA-KaAPC)與OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠(其CD8+T細胞TCR以H-2Kb限制的方式識別OVA257-264)的脾細胞共孵育24小時,通過流式細胞術(shù)檢測T細胞群中CD8+T細胞的凋亡比例以及OVA257-264特異性CD8+T細胞的數(shù)量比例。結(jié)果顯示Kb/OVA-KaAPC能夠誘導(dǎo)大約80%的CD8+T細胞凋亡,OVA257-264特異性CD8+T細胞比例顯著下降83%左右。而無關(guān)抗原肽對照組沒有出現(xiàn)明顯凋亡,OVA257-264特異性CD8+T細胞沒有明顯減少,表明KaAPCs能夠在體外特異性地殺傷抗原特異性CD8+T細胞。其中anti-Fas介導(dǎo)的凋亡為主,活化誘導(dǎo)的凋亡(AICD)極少。在體內(nèi),Kb/OVA-KaAPC經(jīng)尾靜脈注入OT-1鼠后,在不同時間點通過流式細胞術(shù)分析其外周血中CD8+T細胞的凋亡比例及OVA257-264特異性CD8+T細胞的數(shù)量比例。結(jié)果與體外實驗相似,CD8+T細胞凋亡比例最高達75%左右,OVA257-264特異性CD8+T細胞的比例最高下降大約84%,而對照組無顯著變化。KaAPC的殺傷效率與其劑量、作用時間呈正相關(guān)。這表明KaAPC在體內(nèi)也能靶向殺傷抗原特異性的CD8+T細胞。4、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的有效方案的研究：以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為供受體,建立同種異體皮膚移植模型。KaAPCs(包被自制H-2Kb單體和商品化anti-Fas單抗)經(jīng)尾靜脈或局部注入受者鼠后,觀察移植皮塊的生存狀況,進行臨床評分,并通過免疫熒光染色檢測移植皮塊中CD8+T和CD4+T細胞的浸潤量,同時多指標監(jiān)測受者鼠的整體免疫功能。結(jié)果：比較多種方案的效果后,明確了靶向抗原和anti-Fas的包被劑量、KaAPCs的注射途徑、劑量、次數(shù)和時間點等治療措施。據(jù)此,KaAPCs能顯著延長移植皮塊的生存時間達4-6天,并明顯減少移植皮塊中CD8+T細胞的浸潤數(shù)量,對CD4+T細胞無明顯影響,且不明顯抑制受者鼠的整體免疫功能。5、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的優(yōu)化方案及其機制研究：以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bml鼠(H-2Kbml)為供受體,建立同種異體皮膚移植模型。在優(yōu)化方案下,經(jīng)三次尾靜脈注射KaAPCs(包被商品化H-2Kb-Ig二聚體和商品化anti-Fas)治療受者鼠后,觀察移植皮塊的生存狀況和排斥程度；流式細胞術(shù)檢測受者鼠外周血和脾臟中T細胞的凋亡比例及H-2Kb同種反應(yīng)性CD8+T細胞比例；免疫組化分析移植皮塊中浸潤的CD8+ T、CD4+T細胞和H-2Kb同種反應(yīng)性T細胞的量；針對供體的同種增殖能力檢測；脾臟及淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細胞的檢測；KaAPCs對受者鼠脾臟中B、NK、 T細胞以及外周血中單核細胞、中性粒細胞和淋巴細胞群等的影響；通過抗腫瘤能力、T細胞庫針對第三方抗原的同種增殖能力和NK細胞殺瘤能力的分析,監(jiān)測KaAPCs對受者鼠整體免疫功能的影響；觀察KaAPCs在體內(nèi)的運行和分布。結(jié)果顯示：三次尾靜脈輸注后KaAPCs能經(jīng)血流進入淋巴結(jié)和脾臟,并與CD8+T細胞直接接觸,有效地靶向殺傷外周血和脾臟中同種反應(yīng)性CD8+T細胞,殺傷率達82%左右,從而大幅減少了同種反應(yīng)性CD8+T細胞在移植皮塊中的浸潤,同時上調(diào)了淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細胞的水平,最終延長移植皮塊的存活時間達42.5天,且對受者鼠體內(nèi)的其他免疫細胞群沒有明顯影響,也沒有顯著損傷受者鼠的整體免疫功能。結(jié)論：基于PLGA微球的KaAPCs能夠在體外和體內(nèi)選擇性殺傷抗原特異性CD8+T細胞,且能在不損傷受者鼠整體免疫功能的情況下,通過靶向殺傷同種反應(yīng)性CD8+T細胞而有效抑制同種皮膚移植排斥反應(yīng),顯著延長皮膚移植物的存活期。提示KaAPCs可以作為治療移植排斥或自身免疫病的新型特異性免疫治療策略。
[Abstract]:Systematic use of large dose immunosuppressive drugs for the treatment of many side effects caused by graft rejection has contributed to the development of specific immunotherapy for transplant rejection . The selective removal or inhibition of alloreactive T cells is one of the ideal strategies for the treatment of transplant rejection . One of the most recent developments is the inclusion of pMHC multimers and Fas ligands on the surface of non - cellular carriers to prepare killer artificial antigen - presenting cells , Kaolinones . In vivo and in vivo , the H - 2Kb - Ig dimer ( PLGA ) microspheres were used as a carrier to study the specific cytotoxic T - cells in vitro and in vivo . The percentage of CD8 + T cells in peripheral blood and the percentage of OVA257 - 264 specific CD8 + T cells were investigated by flow cytometry . The percentage of T cells in peripheral blood and spleen of recipient mice and the ratio of H - 2Kb alloreactive CD8 + T cells were detected by flow cytometry . The effects of activated CD8 + T , CD4 + T cells and H - 2Kb alloreactive T cells were detected by immunohistochemistry .

【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392.4

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