本文關(guān)鍵詞：鈣結(jié)合蛋白S100A16基因敲除小鼠的構(gòu)建以及S100A16對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)下肥胖小鼠糖脂代謝的影響及其機(jī)制研究　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： S100A16 基因敲除 肥胖 胰島素抵抗 Wnt/β-catenin

【摘要】：目的:構(gòu)建鈣結(jié)合蛋白(Calcium-binding protein)S100A16基因全身敲除小鼠模型,高脂喂養(yǎng)構(gòu)建飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型(Diet induced obesity model,DIO),同時(shí)利用HepG2細(xì)胞系構(gòu)建胰島素抵抗模型,進(jìn)一步探討S100A16的生物學(xué)功能及其在肥胖和胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制。方法:第一步:利用基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(即Cre/loxP系統(tǒng))構(gòu)建S100A16全身敲除小鼠。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡(Western blot,WB)方法驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)。第二步:選用5周齡的S100A16全身敲除小鼠(雜合子小鼠,S100A16Ko+/-)與正常C57BL/6(B6,即野生型Wild type,WT)雄性小鼠為研究對(duì)象,進(jìn)行高脂喂養(yǎng)構(gòu)建飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型。將2種不同基因型的小鼠隨機(jī)分成正常飲食組(No high fat,NFD)和高脂飲食組(High fat,HFD),共4組,①正常對(duì)照組(NFDWT),n=10、②B6高脂組(HFDWT),n=10、③S100A16 Ko+/-普脂組(NFD+/-),n=10、④S100A16Ko+/-高脂組(HFD+/-),n=10。不同飲食喂養(yǎng)13周,每周稱量并記錄小鼠體重、隨機(jī)血糖、于5周齡和17周齡時(shí)進(jìn)行腹腔糖耐量試驗(yàn)(Introperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)和于6周齡和18周齡時(shí)進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)(Insulin tolerance test,ITT)。18周時(shí)取材,取血測(cè)定血清甘油三脂(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Cholesterol,TC)等糖脂代謝相關(guān)生化指標(biāo);記錄附睪、腎周等內(nèi)臟脂肪重量,并利用病理染色方法觀察病理學(xué)改變,同時(shí)應(yīng)用RT-PCR、WB等實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)S100A16及相關(guān)基因在小鼠脂肪及肝臟組織中的表達(dá),初步探索其相關(guān)作用機(jī)制。構(gòu)建動(dòng)物模型的同時(shí)細(xì)胞模型。采用10-7μmol/L胰島素誘導(dǎo)人HepG2肝癌細(xì)胞系產(chǎn)生胰島素抵抗,分析胰島素抵抗與S100A16的關(guān)系。結(jié)果:(1)S100A16基因全身敲除雜合子(S100A16 Ko+-)小鼠可成功飼養(yǎng)繁殖,子代雌雄性別出生率無(wú)差異;目前仍未生出純合子小鼠(KO-/-)。S100A16Ko+/-小鼠脂肪、骨骼肌、肝臟、心肌、肺組織中S100A16轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)量顯著下降。(2)DIO模型中,普脂S100A16 Ko+/-組與正常對(duì)照組相比:體重、脂肪重量、TG、TC、LDL無(wú)明顯差異。給予高脂飲食后,高脂組與普脂組相比:體重、脂肪重量、TG、TC、LDL明顯增加,S100A16、Wnt和β-catenin上調(diào)。高脂S100A16 Ko+/-組與高脂WT組相比:體重、脂肪重量、TG明顯下降,S100A16、Wnt和 β-catenin下調(diào),HDL上調(diào)。(3)胰島素誘導(dǎo)人HepG2細(xì)胞系發(fā)生胰島素抵抗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRS-2下調(diào),S100A16表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:(1)成功建立了 S100A16全身敲除小鼠模型,為進(jìn)一步研究S100A16的生物學(xué)功能及分子機(jī)制提供了動(dòng)物模型。(2)S100A16與體重的增加和脂肪的聚集密切相關(guān),S100A16可能通過(guò)影響Wnt/β-catenin通路從而對(duì)肥胖進(jìn)行調(diào)節(jié)。(3)S100A16與胰島素抵抗相關(guān)。S100A16在機(jī)體廣泛表達(dá),具有多種生物學(xué)功能。未生出純合子小鼠,可能提示我們S100A16與生殖或胚胎致畸相關(guān)。后期,我們可以在細(xì)胞水平利用Wnt/β-catenin通路的特異性阻斷劑ICG-001阻斷這一通路,觀察S100A16的變化。同時(shí)可以利用高通量技術(shù)(基因芯片、質(zhì)譜分析等)篩選相關(guān)作用底物。S100A16與肥胖和胰島素抵抗相關(guān),但其具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。
[Abstract]:Objective: to construct a calcium binding protein (Calcium-binding protein) S100A16 gene knockout mouse model of systemic, construction of high fat diet induced obese mouse model (Diet induced obesity model, food DIO), at the same time using HepG2 cell line construction of the model of insulin resistance, to further explore the biological function of S100A16 in obesity and insulin resistance in rats and its mechanism. Methods: the first step: using gene expression system (Cre/loxP system) to construct S100A16 systemic knockout mice. Using polymerase chain reaction (PCR), real time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR), Western blotting (Western blot WB) method to verify the expression of the transcription and translation level. The second step: a total of 5 weeks of age the body of S100A16 knockout mice (heterozygous mice, S100A16Ko+/-) and normal C57BL/6 (B6, the wild type Wild type, WT) male mice as the research object, construct the high-fat feeding diet Induced obese mice model. 2 different genotypes of mice were randomly divided into normal diet group (No high, fat, NFD) and high-fat diet group (High, fat, HFD), a total of 4 groups: normal control group (NFDWT), n=10, B6 in the high fat group (HFDWT), n=10, S100A16 Ko+/- P (NFD+/-), n=10 fat group, the S100A16Ko+/- high fat group (HFD+/-), n=10. of different diet for 13 weeks, body weight, blood glucose and record the mice were weighed every week, at 5 and 17 weeks of intraperitoneal glucose tolerance test (Introperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) and at 6 weeks of age and 18 weeks of age were insulin tolerance test (Insulin tolerance test, ITT) at.18 weeks, blood serum glycerin three greases (Triglyceride, TG), total cholesterol (Cholesterol, TC) and other lipid metabolism related biochemical indexes; records of epididymis, perirenal fat weight, visceral, and by pathological staining observe the pathologic features and methods. The application of RT-PCR, the expression of WB experimental methods to detect S100A16 and related genes in the liver and adipose tissue in mice, and explore the related mechanism. At the same time cell model animal model. Using 10-7 mol/L human hepatoma cell line HepG2 induced by insulin induced insulin resistance, analysis of the relationship between insulin resistance and S100A16. Results: (1 General) S100A16 gene knockout heterozygous mice (S100A16 Ko+-) can be successfully breeding, progeny sex birth rate had no difference; not yet born mice homozygous (KO-/-).S100A16Ko+/- mice fat, skeletal muscle, liver, myocardium, the expression of the transcription level of S100A16 and protein in lung tissue was significantly decreased (2) DIO model. In general, lipid S100A16 Ko+/- group compared with the normal control group, body weight, fat weight, TG, TC, LDL have no significant difference. Given the high fat diet, high fat group and P group compared fat: body weight, fat weight, TG, TC, LDL increased significantly, S100A16, Wnt and beta -catenin up-regulated. High fat S100A16 Ko+/- group compared with WT group: high fat weight, fat weight, decreased TG, S100A16, Wnt and beta -catenin down regulated by HDL. (3) insulin induced HepG2 cells insulin resistance, the results showed that the down-regulation of IRS-2, the expression level of S100A16 increased. Conclusion: (1) S100A16 has been successfully established systemic knockout mice model and provides an animal model for further study on the biological function and molecular mechanism of S100A16. (2) increased S100A16 and body weight and fat accumulation is closely related to S100A16 may influence the Wnt/ beta -catenin pathway to regulate obesity. (3).S100A16 S100A16 is widely expressed in the body associated with insulin resistance, with a variety of biological functions. Which would suggest that the S100A16 homozygous mice, and reproductive or teratogeny. Later, we can at the cellular level Using specific Wnt/ beta -catenin pathway blocker ICG-001 blocked this pathway, to observe the change of S100A16. At the same time can use high-throughput technologies (microarray, mass spectrometry) screen substrate of.S100A16 with obesity and insulin resistance, but the molecular mechanism needs further study.

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R58;R-332

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本文編號(hào)：1359149