本文關鍵詞：分化狀態(tài)與絲素蛋白纖維物理性狀影響間充質干細胞的遷移及機制研究　出處：《蘇州大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可從自體獲得,取材容易、對供體傷害小、免疫原性弱、且來源廣泛,因此MSCs成為細胞移植治療的理想種子細胞;而MSCs向病變部位的遷移在細胞移植治療中起到至關重要的作用。在體外長期培養(yǎng)的過程中,MSCs可以始終保持其多向分化潛能,包括向神經細胞分化的能力。文獻報道,體內移植的MSCs能夠遷移到大腦病變或損傷部位,參與神經系統(tǒng)在細胞和組織水平上的重建并實現部分功能的恢復;移植后的MSCs能夠分化成神經元和神經膠質細胞等神經類細胞,并可以分泌多種細胞因子保護和促進組織的修復。因此MSCs修復甚至替換喪失功能的神經元從而治療包括外周神經系統(tǒng)損傷以及脊髓損傷、腦梗塞、腦損傷等中樞神經系統(tǒng)疾病成為可能;近年來已有在體外分化成神經樣細胞的MSCs用于動物體內移植治療帕金森綜合征的報道。然而體內試驗證明,只有很少量的MSCs遷移至損傷或病變部位,其中真正分化為神經細胞并行使功能的MSCs更為稀少,大部分移植的細胞停留在注射部位(定點移植)或通過血液循環(huán)(靜脈注射)分散在體內多處。因此,提高MSCs的定向遷移能力,增加遷移到損傷部位的移植細胞數量對改善治療至關重要。MSCs定向遷移或趨化性遷移受到多種因素的調控,其中細胞因子和化學趨化因子在這一過程中起到非常重要的作用。體內外實驗證明神經系統(tǒng)損傷區(qū)域會分泌基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α),SDF-1α與其受體CXCR4特異性結合,激活PI3K/Akt和MAPKs信號通路,導致細胞骨架重組,從而誘導MSCs定向遷移,廣泛參與體內多種病理、生理反應,包括血管生成、心臟發(fā)育以及帕金森綜合征的神經保護等,表明SDF-1α在神經系統(tǒng)損傷修復中非常重要。除了趨化因子影響MSCs的定向遷移,許多內在因素,包括MSCs對因子的不同應答程度也是影響其定向遷移的重要因素。MSCs對趨化因子的應答可能與其分化程度密切相關。研究表明,不同組織來源和處于不同細胞周期的MSCs具有不同的遷移能力,對趨化因子的應答也存在差異。由于移植的細胞是一個細胞群體,其中含有處于不同分化階段的細胞,對趨化因子產生應答作用的MSCs很有可能只是處于特定分化狀態(tài)的細胞群體,弄清這些細胞的特性,闡明它們對趨化因子表現的高趨向性機理,不僅對于揭示MSCs定向遷移的分子機制具有重要的理論意義,而且有利于發(fā)現MSCs趨化性遷移的條件和分化狀態(tài),為今后細胞移植治療神經系統(tǒng)疾病提供實驗和理論基礎。本研究通過堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)聯合丁羥基茴香醚(butyl hydroxyl anisol,BHA)誘導MSCs成神經分化,分為5個狀態(tài),分別是未分化、預誘導24 h、誘導5 h、維持18 h和維持48 h;運用Boyden chamber實驗和Western blot檢測不同分化狀態(tài)的MSCs對SDF-1α趨化性應答差異及其內在分子機制,得到了以下結果:SDF-1α誘導的MSCs趨化性遷移與其分化狀態(tài)密切相關為了探討MSCs的趨化性遷移和它們成神經分化狀態(tài)之間的關系,利用Boyden chamber檢測了MSCs向不同濃度(0-100 ng/ml)的SDF-1α的趨化性遷移。結果發(fā)現25 ng/ml的SDF-1α可以促進未分化、預誘導24 h、誘導5 h、維持18 h的MSCs遷移,5、50 ng/ml的SDF-1α均能夠引起預誘導24 h、誘導5 h、維持18 h的MSCs遷移,但趨化性應答程度不同,而100 ng/ml的SDF-1α僅能夠引起預誘導24 h和誘導5 h階段的MSCs發(fā)生趨化性遷移。以上數據說明分化狀態(tài)不同,MSCs向SDF-1α趨化遷移能力存在顯著差異,MSCs定向遷移行為與分化狀態(tài)密不可分。預誘導24 h的MSCs具有最強的趨化遷移能力為了尋找MSCs成神經分化過程中向SDF-1α定向遷移能力較強的某個特定分化狀態(tài),我們檢測了不同分化狀態(tài)的MSCs向25 ng/ml的SDF-1α的趨化應答。結果顯示預誘導24 h的MSCs相較于其它狀態(tài)對25 ng/ml的SDF-1α表現出較強的趨化反應,說明預誘導24 h的MSCs具有最強定向遷移能力,同SDF-1α未刺激組相比有1.53倍提升。PI3K/Akt和MAPKs信號通路的激活程度與細胞的分化狀態(tài)密切相關前期實驗發(fā)現SDF-1α刺激后不同分化狀態(tài)的MSCs的遷移能力不同,那么與細胞遷移密切相關的PI3K/Akt和MAPKs信號通路是否參與調節(jié)SDF-1α誘導的細胞遷移呢?于是我們通過Western blot檢測了SDF-1α處理成神經分化不同狀態(tài)的MSCs后PI3K/Akt和MAPKs信號通路關鍵分子的磷酸化水平,其中包括Akt、ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK。首先使用不同濃度的SDF-1α(0-100ng/ml)處理未分化的MSCs,檢測發(fā)現PI3K/Akt和MAPKs信號通路關鍵分子的磷酸化水平呈現濃度依賴性,25 ng/ml的SDF-1α能夠顯著提高未分化的MSCs中Akt、ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平。接下來我們檢測了不同分化狀態(tài)的MSCs中這些信號分子的磷酸化水平,結果發(fā)現:不同分化狀態(tài)的MSCs均表達基底水平的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK;與未分化的MSCs相比,Akt和ERK1/2的磷酸化水平在誘導5 h和維持48 h階段提高,p38MAPK磷酸化水平在維持18 h和48 h階段提高;磷酸化的SAPK/JNK在維持18 h的MSCs中顯著提高,而在預誘導24 h和維持48 h的MSCs中下降。以上結果說明分化狀態(tài)的不同直接影響著PI3K/Akt和MAPKs關鍵信號分子基底水平的磷酸化表達。SDF-1α刺激后引起的PI3K/Akt和MAPKs信號通路關鍵分子的激活時間與持續(xù)時間在不同分化狀態(tài)的細胞中有較大差異接下來我們使用25 ng/ml的SDF-1α處理不同分化狀態(tài)的MSCs不同時間(0、5、15、30和60 min)進一步檢測這些信號分子的磷酸化水平,SDF-1α處理后,未分化及維持18 h的MSCs中Akt磷酸化從5 min開始增加,但持續(xù)時間不同,在誘導5 h和維持48 h的MSCs中發(fā)生下降;ERK1/2磷酸化從SDF-1α刺激5 min時,未分化、誘導5 h、維持18 h狀態(tài)的MSCs水平升高,但磷酸化程度及持續(xù)時間各不相同;SAPK/JNK磷酸化在預誘導24 h的MSCs中SDF-1α刺激5 min時顯著升高并且持續(xù)到60 min,在所有維持狀態(tài)的MSCs中SAPK/JNK的磷酸化水平從5 min開始降低并持續(xù)到60 min;p38MAPK磷酸化水平,僅在未分化的MSCs中SDF-1α處理后15 min和60 min時顯著提高,在維持18 h的MSCs中p38MAPK水平在15min時顯著升高,并在30 min時降到基底水平,在60 min時發(fā)生降低。這些結果說明,不同分化狀態(tài)的MSCs中PI3K/Akt和MAPKs對SDF-1α的應答存在差異。PI3K/Akt和MAPKs信號通路參與調節(jié)SDF-1α誘導的不同分化狀態(tài)MSCs的定向遷移為了進一步分析PI3K/Akt和MAPKs信號通路在SDF-1α誘導的MSCs遷移過程中的作用,分別采用30μM LY294002(PI3K/Akt抑制劑)、50μM PD98059(ERK1/2抑制劑)、30μM SB203580(p38MAPK抑制劑)或10μM SP600125(SAPK/JNK抑制劑)預處理不同成神經分化狀態(tài)下的MSCs 30 min,將細胞置于Boyden chamber裝置中,檢測其向25 ng/ml SDF-1α定向遷移的情況。結果顯示,阻斷PI3K/Akt信號顯著降低了未分化、維持18 h和維持48 h的MSCs遷移至下室的細胞數;阻斷SAPK/JNK信號抑制了SDF-1α誘導的未分化、預誘導24 h、維持18 h和維持48 h的MSCs遷移;阻斷ERK1/2信號減少了誘導5 h和維持48 h的MSCs遷移數目;阻斷p38MAPK信號抑制了維持18 h和48 h的MSCs遷移�？傊�,PI3K/Akt和MAPKs信號通路參與調節(jié)SDF-1α誘導的MSCs遷移,而其程度則依賴于MSCs分化狀態(tài)。上述實驗結果表明,特定分化狀態(tài)的MSCs相較于其他狀態(tài)擁有更強的遷移能力和趨化反應,說明了分化狀態(tài)對MSCs遷移的重要作用,我們可以充分利用特定分化狀態(tài)的MSCs進行細胞移植從而更有效地改善一些神經類疾病的結構和功能修復。神經損傷不僅造成了損傷區(qū)域大量細胞的丟失,而且改變了局部微環(huán)境,損傷區(qū)域有大量膠質細胞的浸潤和結締組織增生,導致了膠質瘢痕的形成,不利于神經損傷恢復,難以重建中樞神經系統(tǒng)。因此,具有較強遷移能力的MSCs不僅需要到達損傷部位,分化成神經樣細胞,更為重要的是與周圍環(huán)境建立聯系,進而分泌一些神經營養(yǎng)因子,促進神經系統(tǒng)損傷恢復,這是影響療效的一個至關重要的因素。針對上述問題,我們認為或許可以利用組織工程的方法,尋找一種合適的仿生材料,模擬細胞外基質錯綜復雜的蛋白網絡結構,為MSCs生長提供粘附點,幫助和引導MSCs定向有序地遷移至受損部位,從而促進神經修復。絲素蛋白(silk fibroin,SF)易加工成各種形狀且在生物體內降解可控,這兩大優(yōu)勢使其成為一種極具開發(fā)潛力的醫(yī)用組織工程替代品,目前模擬天然細胞外基質的納米結構成為組織工程修復運用的焦點,本文開展的第二部分內容是借助再生SF纖維與MSCs極好的生物相容性,制備細胞外基質仿生材料,研究不同直徑(100、200、400 nm)和不同走向(平行或亂序)的SF纖維對不同分化狀態(tài)MSCs粘附、鋪展、生長和遷移等特性的影響,尋找最適合MSCs生長、遷移的最佳SF纖維的物理性狀以及MSCs成神經分化過程中的最佳細胞狀態(tài),為今后利用神經組織工程移植的辦法治療神經損傷提供理論指導。第二部分研究結果如下:直徑100、200 nm的SF纖維更有助于MSCs粘附生長;SF纖維支持不同分化狀態(tài)MSCs生長我們將P5代的MSCs分別接種到不同直徑的SF纖維以及對照組多聚賴氨酸(poly-L-lysine,PLL)上,培養(yǎng)3 d、6 d、9 d,結果發(fā)現培養(yǎng)3 d時,100、200 nm小直徑SF纖維上的MSCs的粘附能力明顯高于對照組。培養(yǎng)6 d時,發(fā)現SF纖維上的MSCs都發(fā)生了增殖。培養(yǎng)9 d時,直徑100、200 nm SF纖維上的MSCs增殖快,明顯高于對照組。實驗結果表明直徑100、200 nm SF纖維更有助于MSCs的增殖,可能是由于纖維直徑的變細而增加了表面積,而較高的表面積可以從培養(yǎng)基中攝取更多的粘附蛋白基團,從而為細胞的附著和生長提供更多的粘著點。接著我們研究了不同直徑的SF纖維對成神經分化過程中不同分化狀態(tài)MSCs生長的影響,發(fā)現SF纖維上細胞分化形態(tài)及細胞存活率與對照組無差異,說明SF纖維支持不同分化狀態(tài)MSCs生長。SF纖維有助于提高MSCs某些特定分化狀態(tài)的遷移速率,而SF纖維直徑和MSCs分化狀態(tài)直接影響其遷移速率MSCs的運動能力直接影響治療效果,如果能夠更好地弄清MSCs在SF纖維上的遷移行為,無疑為MSCs進行臨床移植治療帶來希望。本實驗采用10代以內的MSCs,接種在不同直徑和不同走向的SF纖維上,將其成神經誘導分化,進行體外培養(yǎng),結合活細胞顯微攝影實時跟蹤,分析不同直徑的SF纖維對成神經分化過程中不同分化狀態(tài)MSCs遷移能力的影響。結果發(fā)現直徑100、200 nm SF纖維能夠顯著提高未分化、預誘導24 h和誘導5 h的MSCs遷移速率(speed),而直徑400 nm SF纖維僅提高了未分化和預誘導24 h MSCs的遷移速率,SF纖維上維持18 h和維持48 h MSCs遷移速率與對照組無顯著差異。結果說明SF纖維能夠促進MSCs成神經分化過程中某些特定分化狀態(tài)細胞的遷移速率;不同分化狀態(tài)的細胞遷移速率不同,其中預誘導24 h的MSCs具有最強的遷移速率。直徑200 nm和400 nm平行排列的SF纖維顯著提高了不同狀態(tài)MSCs的遷移效率衡量細胞遷移能力的要素有2個,一個是遷移速率,另一個則是遷移效率(forward migration index,FMI)。遷移效率是指細胞遷移的直線距離/總距離,反應了細胞遷移持續(xù)性。我們的實驗結果發(fā)現平行SF纖維上MSCs的遷移效率顯著高于對照組和亂序組,說明平行排列的SF纖維能夠引導細胞沿著纖維遷移,大大提高了MSCs的遷移效率,充分說明SF纖維的走向對MSCs的遷移具有導向作用;不同分化狀態(tài)的MSCs具有不同的遷移效率,預誘導24 h的MSCs遷移效率最高;直徑200 nm和400 nm平行SF纖維顯著提高了成神經分化過程中不同狀態(tài)MSCs的遷移效率,而100 nm的SF纖維有助于未分化、預誘導24 h和誘導5 h的MSCs遷移。SF纖維直徑不同,不同分化狀態(tài)MSCs中PI3K/Akt和ERK1/2信號通路關鍵信號分子的磷酸化表達不同我們前期研究發(fā)現PI3K/Akt和ERK1/2信號參與了各種生長因子激活下游信號分子介導細胞遷移,那SF纖維提高不同分化狀態(tài)MSCs的遷移速率是否也通過PI3K/Akt和ERK1/2信號通路?于是,我們選擇直徑為200 nm和400 nm SF纖維以及3種不同的分化狀態(tài)(未分化,預誘導24-h和維持18-h,這3種狀態(tài)分別代表對照組、成神經分化過程中MSCs具有高遷移能力組和低遷移能力組)進行研究。結果表明,在3個不同分化狀態(tài)的MSCs中,培養(yǎng)在200 nm SF纖維上的MSCs,與PLL組相比,ERK1/2的磷酸化水平增強,而直徑400 nm的SF纖維只激活未分化和預誘導24 h的MSCs中ERK1/2信號。同時,預誘導24 h的MSCs中PI3K/Akt信號不管是在直徑200 nm還是400 nm SF纖維上均被激活,另外,直徑200 nm SF纖維上未分化MSCs和400 nm SF纖維上維持18 h MSCs中Akt的磷酸化也升高。上述結果表明,不同SF纖維直徑與分化狀態(tài)直接影響PI3K/Akt和ERK1/2信號通路關鍵分子磷酸化。PI3K/Akt和ERK1/2信號通路參與調節(jié)SF纖維上不同分化狀態(tài)MSCs的遷移為了進一步研究PI3K/Akt和ERK1/2信號通路在SF纖維促進的MSCs遷移過程中的作用,我們分別用PI3K/Akt和ERK1/2信號關鍵分子Akt和ERK1/2的抑制劑LY294002和PD98059預處理MSCs 30 min,通過活細胞工作站實時跟蹤拍攝3個不同分化狀態(tài)的細胞在直徑200 nm和400 nm SF纖維上的遷移軌跡,計算遷移速率。結果表明,當用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路后,培養(yǎng)在直徑200 nm的SF纖維上未分化和維持18 h的MSCs遷移速率明顯降低,阻斷ERK1/2信號通路后明顯抑制了預誘導24 h和維持18 h的細胞遷移速率;對于直徑400 nm SF纖維組,抑制PI3K/Akt和ERK1/2信號通路均削弱了未分化和預誘導24 h的MSCs遷移速率。這些結果表明,PI3K/Akt和ERK1/2信號通路介導了不同分化狀態(tài)MSCs在SF纖維上的遷移。本論文第一部分研究工作發(fā)現不同分化狀態(tài)的MSCs具有不同的遷移能力,對不同濃度的SDF-1α趨化性應答也不同,對SDF-1α產生應答作用的MSCs很有可能只是處于某個特定分化階段的MSCs才表現出超強的趨化遷移能力,提示MSCs的遷移能力和它們的分化狀態(tài)密切相關。論文第二部分研究發(fā)現直徑100、200 nm的SF纖維促進MSCs粘附與生長;不同直徑的SF纖維支持不同分化狀態(tài)MSCs的生長;平行排列的SF纖維能夠引導細胞遷移持續(xù)性,直徑介于200 nm與400 nm平行排列的SF纖維顯著提高了不同分化狀態(tài)MSCs的遷移效率;PI3K/Akt和ERK1/2信號通路參與調控SF纖維上MSCs的遷移。綜上所述,將處于特殊分化狀態(tài)具有最強遷移能力的細胞群體與適合MSCs生長的最佳性狀的SF纖維一同移植入體內,為臨床應用MSCs治療中樞神經系統(tǒng)疾病及損傷修復提供一個理論參考。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2

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本文編號：1351572