發(fā)布時間：2017-12-29 05:04

  本文關鍵詞：基于煙霧暴露誘導彈性蛋白參與自身免疫反應的慢阻肺動物模型的構建及其機制研究　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 香煙煙霧 elastin T細胞 氣道炎癥 氣道粘液高分泌 慢性阻塞性肺病

【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病,其主要表現(xiàn)為持續(xù)的氣道炎癥和粘液高分泌,不完全可逆的氣流受限和氣道重構等特征。煙霧暴露是慢阻肺最重要的危險因素之一,但目前煙霧暴露誘發(fā)慢阻肺氣道炎癥的分子機制并不明確,且臨床上對慢阻肺仍缺乏有效的預防和治療手段,而缺乏一種成熟的、統(tǒng)一的慢阻肺動物模型則成為主要的限制因素之一。肺內(nèi)彈性蛋白(elastin,Eln)是一種由高度交聯(lián)的賴氨酸殘基縮合所形成的不溶性蛋白質,其水溶性的前體(tropoelastin)可以被中性粒細胞和巨噬細胞分泌的彈性蛋白酶降解成可溶性的彈性蛋白多肽片段。越來越多的研究表明,在慢阻肺患者和吸煙者中均可檢測到彈性蛋白的降解片段,且檢測elastin特有片段,即交聯(lián)的鎖鏈素和異鎖鏈素也已成為慢阻肺診斷的生物學指標之一。故而越來越多的研究者提出elastin可能作為一種自體抗原(self-antigen),通過抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)提呈而介導了慢阻肺氣道炎癥的自免疫反應。然而,目前還幾乎沒有任何動物實驗數(shù)據(jù)證明elastin在吸煙誘導的慢阻肺氣道炎癥中的關鍵作用。慢阻肺的炎癥與免疫機制非常復雜,目前已有的研究表明,香煙煙霧暴露可先后激活體內(nèi)的固有免疫和適應性免疫系統(tǒng),而適應性免疫主要依賴于T細胞的作用。在肺局部的淋巴結內(nèi),抗原提呈細胞(包括肺泡巨噬細胞和樹突狀細胞)將攝取的抗原遞呈給相應的T細胞,使其活化,增殖并發(fā)生分化,最終形成效應性T細胞。而效應性T細胞主要包括細胞毒性T細胞(CD8+)和輔助性T細胞(CD4+),已有的臨床研究結果顯示Tc1與Th17細胞與慢阻肺的關系較為密切,也有動物實驗的結果證實Th1及Th17細胞在吸煙誘導的肺部炎癥中起重要作用。但是,這些亞型的T細胞是否參與慢阻肺的自身免疫及其具體的作用機制目前仍沒有明確的研究與解釋。為了研究上述問題,我們首次在e1astin作為慢阻肺自身抗原的理論基礎上,成功構建了香煙煙霧暴露聯(lián)合elastin短期給藥的CE-急性炎癥模型,及香煙煙霧暴露聯(lián)合elastin長期給藥的CE-慢性肺氣腫模型。而在上述模型的基礎上,我們利用體內(nèi)實驗與體外實驗相結合的方法,分別研究了香煙煙霧暴露、elastin,肺內(nèi)巨噬細胞、APC及Th1,Th17細胞在慢阻肺自免疫過程中的作用及機制。第一部分香煙煙霧暴露聯(lián)合彈性蛋白誘導的新型慢阻肺小鼠動物模型的建立目的:利用慢阻肺發(fā)病機制中elastin作為自身抗原的自免疫機制,聯(lián)合香煙煙霧暴露,構建一種新型的,快捷高效的符合人慢阻肺發(fā)病機制及疾病特點的小鼠慢阻肺動物模型。方法:在急性炎癥模型中,將C57BL/6小鼠(雄性,6-8周,8-10只/組)按體重隨機分為4組,即Air+NS組(對照組),Air+Eln組(單純elastin給藥組),CS+NS(單純CS暴露組)及CS + Eln組(模型組)。CS+NS及CS+Eln組給予香煙煙霧暴露(周100支/天,5天/周,共2周),間隔2周后,Air+Eln組及CS+Eln組給予氣道滴注Eln(elastin,50ug/只/次)。末次給藥24h后處理小鼠,收集標本。一部分小鼠左肺先進行支氣管細胞灌洗(BALF),行白細胞總數(shù)及分類細胞的計數(shù),然后灌注4%多聚甲醛內(nèi)固定,制成病理切片觀察炎癥浸潤和氣道粘液分泌。小鼠右肺用于提取mRNA和蛋白,用熒光定量PCR或ELISA法檢測相關分子的表達和分泌。另外一部分小鼠無菌條件下行PBS血流灌注后取雙肺,經(jīng)膠原酶消化及濾膜過濾后制備成單個核細胞懸液,經(jīng)體外刺激后以流式檢測肺組織中各個T細胞亞型的變化。在慢性肺氣腫模型中,將C57/6小鼠(雄性,6-8周,8-10只/組)按體重隨機分為2組,即Air+NS組(對照組),CS+Eln組(模型組)。香煙煙霧暴露過程同急性模型,間隔2周后,CS+Eln組(模型組)組間隔一天給予氣道滴注Eln(elastin,彈性蛋白,50ug/只/次)達1個月(共15次)。末次給藥24h后處理小鼠,收集標本。模型小鼠每2周檢測體重,一部分小鼠左肺先進行支氣管細胞灌洗液(BALF),行白細胞總數(shù)及分類細胞的計數(shù),然后灌注4%多聚甲醛內(nèi)固定,制成病理切片觀察氣道粘液分泌、小氣道膠原沉積及肺泡內(nèi)襯間隔。右肺提取蛋白,Western Blot檢測細胞凋亡及細胞核壞死相關蛋白的表達。一部分小鼠在淺麻醉下用BUXCO-DFS儀器行肺功能檢測。結果:香煙煙霧暴露聯(lián)合elastin短期給藥可明顯誘導小鼠氣道炎癥及粘液高表達,且其BALF上清中Th1,Th17相關的前炎癥因子(IL-6)和趨化因子(CXCL1,CXCL2)的表達較對照組及單純熏煙組或單純elastin給藥組均有明顯升高,而Th2相關的炎癥因子(IL-4,IL-13)表達則無明顯差異。其肺組織中IFN-y和IL-17A蛋白的表達明顯升高,且全肺流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)其T細胞亞型中以Th17增加最為明顯。而我們的研究還發(fā)現(xiàn)雖然elastin聯(lián)合弗氏佐劑致敏,再給予elastin短期給藥也可誘導一定的氣道炎癥細胞浸潤及炎癥因子和趨化因子的表達升高,但是其升高水平均不如CE急性模型,且其肺組織中T細胞亞群的增加以Th1為主。我們還同時嘗試了 elastin(腹膜腔致敏)+elastin(短期氣道給藥)模型和熏煙(CS)+熏煙(CS)模型,發(fā)現(xiàn)這2種模型均不能誘導氣道炎癥。這些結果說明,CE-急性模型才是最符合慢阻肺急性炎癥特點的模型。繼而我們用香煙煙霧暴露聯(lián)合elastin長期給藥的方法嘗試構建了 CE-肺氣腫模型,發(fā)現(xiàn)在該模型構建過程中,模型組小鼠體重雖然也一直都有所增加,但是從造模第4周開始模型組小鼠體重明顯輕于對照組小鼠體重,一直到模型結束。且模型組在誘導氣道炎癥的同時,亦可誘導氣道粘液的高表達,小氣道周圍膠原沉積。肺功能檢測結果顯示,模型組小鼠FEV20(ml,Forced expiratory volume in 20ms,20ms用力呼氣量相,當于人肺功能的FEV1指標)及FEV20/FVC(%,Forced expiratory volume in 20ms/Forced vital volume,20ms 用力呼氣量相/用力肺活量,相當于人的FEV1/FVC)較對照組明顯降低。模型組小鼠肺泡內(nèi)襯間隔增加,說明存在肺氣腫病理表型。同時,WB檢測肺組織細胞凋亡(Caspase-3,Caspase-9)及細胞核凋亡(RIP,RIP3)相關蛋白表達均明顯增加。這些結果說明,香煙煙霧暴露聯(lián)合elastin長期給藥的方法可以成功誘導肺氣腫產(chǎn)生,且細胞凋亡及細胞核死亡都參與了該過程的發(fā)生與發(fā)展。結論:香煙煙霧暴露聯(lián)合elastin短期(3天)給藥可成功模擬人慢阻肺急性炎癥的特點,從而構建小鼠慢阻肺急性炎癥模型,而香煙煙霧暴露聯(lián)合elastin長期(30天)給藥可成功模擬人慢阻肺肺氣腫的特點,從而構建小鼠慢阻肺肺氣腫模型。與既往的慢阻肺動物模型相比,我們的CE模型氣道炎癥更明顯(中性粒細胞比例高),氣道粘液高表達,具有Th1/Th17細胞免疫反應,氣道重構,肺功能下降,肺氣腫增加等特點,且造模時間更短,操作簡便,易于統(tǒng)一及重復。第二部分香煙煙霧暴露聯(lián)合彈性蛋白誘導的慢阻肺動物模型自身免疫機制研究目的:通過我們前期構建的慢阻肺動物模型,研究香煙煙霧暴露,elastin,肺泡巨噬細胞及肺APC細胞等在慢阻肺自身免疫發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用及機制。方法:將C57/6小鼠(雄性,6-8周,8-10只/組)按體重隨機分為2組,CS組(香煙煙霧暴露組)和Air組(空氣對照組)。CS組按前述方法給予香煙煙霧暴露2周。末次暴露24h后處理小鼠,收集標本。一部分小鼠全肺行支氣管肺泡灌洗(BALF),BALF細胞提取mRNA及蛋白,熒光定量PCR及WB檢測MMP-12的表達。一部分小鼠BALF上清丙酮沉淀蛋白后,及肺組織提取蛋白后,WB檢測elastin的表達。一部分小鼠全肺APC(磁珠分選)細胞與脾臟CD4+T細胞(磁珠分選)共培養(yǎng),給予elastin體外刺激3天后,流式細胞術檢測Th細胞亞群的分化。為了進一步驗證elastin在CE模型中的重要作用,我們在構建CE-急性模型的同時,增加了 CS+BA4組(BA4為elastin中和抗體,每天熏煙前給予10ug/只/次的BA4氣道給藥)。一部分小鼠左肺先進行支氣管細胞灌洗液(BALF),行白細胞總數(shù)及分類細胞的計數(shù),然后灌注4%多聚甲醛內(nèi)固定,制成病理切片觀察炎癥浸潤和氣道粘液分泌。小鼠右肺用于提取mRNA和蛋白,用定量熒光PCR或ELISA法檢測相關分子的表達和分泌。一部分小鼠全肺APC(磁珠分選)細胞與脾臟CD4+T細胞(磁珠分選)共培養(yǎng),給予elastin體外刺激3天后,流式細胞術檢測TTh細胞亞群的分化。為了進一步驗證Th17在CE模型中的重要作用,我們用IL-17A敲除小鼠及其同窩對照構建了 CE-急性模型。小鼠左肺先進行支氣管細胞灌洗液(BALF),行白細胞總數(shù)及分類細胞的計數(shù),然后灌注4%多聚甲醛內(nèi)固定,制成病理切片觀察炎癥浸潤和氣道粘液分泌。小鼠右肺用于提取mRNA和蛋白,用定量熒光PCR或ELISA法檢測相關分子的表達和分泌。結果:我們發(fā)現(xiàn)熏煙2周小鼠BALF細胞中巨噬細胞特異性分泌的基質金屬蛋白酶MMP-12的mRNA及蛋白水平的表達較對照組有顯著升高。這說明短期的香煙煙霧暴露可以激活肺泡巨噬細胞,從而使肺部MMP-12的分泌增加。而我們同時檢測了熏煙2周小鼠BALF細胞和肺組織中的elastin的表達,其相較于對照組,確實有一定的增加,說明MMP-12的分泌增加后,極有可能導致肺組織彈性纖維的降解,而導致游離的elastin及其多肽的表達升高。熏煙2周小鼠T細胞體外培養(yǎng)實驗還證實,elastin可在體外,刺激熏煙小鼠CD4+T細胞向Th1及Th17細胞分化增加。這些結果為elastin作為一種自身免疫抗原參與慢阻肺的發(fā)病過程提供了直接證據(jù)。我們用elastin的中和抗體,BA4干預CE-急性模型后,發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制CE誘導的氣道炎癥(如BALF細胞總數(shù)明顯降低,中性粒細胞總數(shù)及比例明顯緩解,HE病理顯示炎癥細胞浸潤緩解及ELISA結果顯示炎癥因子-IL-6及趨化因子CXCL1等表達明顯下降)及氣道粘液高分泌(病理切片PAS染色顯示粘液表達明顯降低)。且T細胞體外培養(yǎng)的結果顯示,BA4可明顯抑制elastin對Th細胞的誘導分化。這些結果都進一步證實了 elastin在慢阻肺自身免疫過程中的重要作用。用IL-17A KO及其同窩對照小鼠構建CE-急性模型,發(fā)現(xiàn)在IL-17缺失后,CE誘導的氣道炎癥(如BALF細胞總數(shù)明顯降低,中性粒細胞總數(shù)及比例明顯緩解,HE病理顯示炎癥細胞浸潤緩解及ELISA結果顯示炎癥因子-IL-6及趨化因子CXCL1,CXCL2)及氣道粘液高分泌(病理切片PAS染色)均被明顯抑制。這些結果都進一步說明了 Thl7細胞及IL-17A因子參與并調(diào)節(jié)了慢阻肺的自身免疫過程。結論:我們的研究,首次在小鼠動物實驗中證實,香煙煙霧暴露可激活肺巨噬細胞,使其分泌的MMP-12增加,從而降解肺組織彈性纖維,使elastin及其多肽產(chǎn)生增加。肺內(nèi)增加的elastin及其多肽可被肺內(nèi)APC所攝取,并將其遞呈給Th1及Th17細胞,從而使IFN-γ和IL-17A的分泌增加,進一步驅化和誘導以巨噬細胞及中性粒細胞為主的炎癥細胞,從而使肺組織進一步降解,產(chǎn)生更多的elastin及其多肽。該過程反復進行,逐步加重肺內(nèi)炎癥和肺組織結構和功能破壞,最終導致肺氣腫的形成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R563.9;R-332

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本文編號：1348885