發(fā)布時間：2017-12-28 06:03

  本文關(guān)鍵詞：培土清心顆粒對特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型的免疫干預(yù)研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：本研究為廣東省中醫(yī)藥強省建設(shè)專項中醫(yī)優(yōu)勢病種突破項目(粵財社[2015]19號)、特應(yīng)性皮炎臨床和基礎(chǔ)研究(粵財社[2011]572號)中的部分研究內(nèi)容。課題組前期開發(fā)研制了具有健脾益氣、抗炎止癢的培土清心顆粒(PTQX顆粒),初步建立具有明顯皮損的小鼠模型,并驗證了其在特應(yīng)性皮炎(AD)中的臨床療效。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上構(gòu)建AD樣小鼠模型和相關(guān)評價指標,觀察PTQX顆粒對AD樣小鼠模型免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的影響。研究主要分為2部分。第一部分動物模型構(gòu)建及評價體系的建立目的：參考國內(nèi)外文獻中特應(yīng)性皮炎相關(guān)動物模型的造模方法,建立特應(yīng)性皮炎樣動物模型及相關(guān)評價體系。方法：1.以“特應(yīng)性皮炎”、“AD”、“動物模型”等為檢索詞,查找相關(guān)文獻數(shù)據(jù)庫,根據(jù)文獻質(zhì)量評價進行數(shù)據(jù)提取和分析,參考國內(nèi)外特應(yīng)性皮炎動物模型中動物種屬、性別選擇及具體模型構(gòu)建方法,篩選適宜的實驗動物種屬、動物性別和造模方法；2.模型建立后,綜合遲發(fā)性超敏反應(yīng)及慢性濕疹評價指標,采用皮損評分、行為觀察記分、搔抓次數(shù)、耳廓厚度、皮膚病理、血清學(xué)等指標評價模型的病癥特點。結(jié)果：1.國內(nèi)外特應(yīng)性皮炎樣動物模型研究中,建立AD樣動物模型的研究對象宜選用雌性C57BL/6或BALB/c小鼠,采用半抗原刺激誘導(dǎo)法造模,誘導(dǎo)藥物采用2,4-硝基氟苯(DNFB)；2.與正常對照組比較,模型組小鼠背部皮損病理表現(xiàn)為明顯角化過度、角化不全,棘層肥厚,表皮層、真皮淺層見明顯炎性細胞浸潤；血清中IgE、IL-4含量均明顯升高(P0.01),而IFN-γ未見明顯變化(P0.05)。3.造模結(jié)束后,模型組小鼠皮損評分、行為觀察積分、搔抓次數(shù)、耳廓厚度等觀察指標與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。其中行為觀察記分呈先升后降趨勢,與同時點正常組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；模型組小鼠搔抓次數(shù)明顯上升、皮損評分、耳廓厚度顯著增加(P0.01)。結(jié)論：1.采用DNFB誘導(dǎo)法可成功建立AD樣小鼠模型,所建立的AD樣模型皮膚組織呈較典型慢性改變,血清學(xué)表現(xiàn)提示皮膚炎癥表現(xiàn)以Th2型細胞為主；2.造模后模型組小鼠顯示出較明顯的慢性炎癥性皮損,伴有瘙癢,與人類AD非常相像,其中皮損記分、瘙癢程度、耳廓厚度、組織病理及血清學(xué)改變等可作為判斷該模型成功與否的重要依據(jù)。第二部分PTQX顆粒對AD樣小鼠的免疫調(diào)控機制研究目的：通過PTQX顆粒干預(yù)AD樣小鼠模型,從模型構(gòu)建影響、血清和皮損細胞因子變化、脾臟Breg細胞數(shù)量變化等方面探討其影響AD免疫調(diào)控的可能機制。方法：1.將雌性C57BL/6小鼠隨機分為4組,即正常組、模型組、PTQX高劑量組(臨床2倍劑量,PTQX顆粒1.56g/kg·d)、PTQX低劑量組(臨床等效劑量,PTQX顆粒0.78g/kg·d)。各組小鼠給藥方式是灌胃,培土清心用藥組用不同濃度水溶液灌胃,正常組和模型組同法給予等體積的蒸餾水,造模第一天開始用藥,連續(xù)給藥14天；實驗第1天、第7天、第14天觀察各組小鼠行為觀察記分、搔抓次數(shù)、皮損評分、耳廓厚度等指標；2.采用DNFB反復(fù)刺激誘導(dǎo)方法造模,造模前備皮(大小約2.5cm×1.5cm)。造模第一天背部外涂0.5%DNFB溶液25μl致敏,其后第5天、第8天、第11天、第14天在小鼠右耳背面、背部外涂0.2%的DNFB溶液20μl誘發(fā)皮炎,左耳外涂基質(zhì)溶液20μl作對照組；實驗結(jié)束48小時內(nèi)予眼球摘除法處死,取背部皮損處全層皮膚做皮膚常規(guī)病理和肥大細胞計數(shù)變化(甲苯胺藍染色)；3.采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測小鼠血清中IgE的含量,液相芯片法測定血清中IFN-γ、IL-4、IL-10的含量；4.提取小鼠背部皮膚組織中總RNA,并鑒定其濃度和純度,采用定量即時聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)擴增后檢測其皮膚組織中IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA表達水平；5.取小鼠脾臟,分離并培養(yǎng)脾臟淋巴細胞,處理后采用流式細胞術(shù)檢測脾臟細胞中調(diào)節(jié)性B細胞(Breg)水平數(shù)量及變化。結(jié)果：1.造模結(jié)束后,模型組小鼠搔抓次數(shù)、皮損評分、耳廓厚度較正常組明顯升高(P0.01),給予PTQX顆粒后,小鼠搔抓次數(shù)、皮損評分、耳廓厚度均明顯降低(P0.01)；行為觀察記分趨向于正常,與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；皮膚組織病理棘層肥厚較模型組減輕,皮膚炎性細胞浸潤減少,肥大細胞計數(shù)明顯降低(P0.01)；2.與正常對照組比較,模型組小鼠血清IgE、IL-4含量增加(P0.01),血清IFN-γ、IL-10未見明顯改變(P0.05),給予PTQX顆粒后,PTQX高劑量組與PTQX低劑量組小鼠血清中IgE含量均明顯降低(P0.05),PTQX低劑量組小鼠血清中IL-4含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),PTQX高劑量組血清中IL-4含量與模型組比較呈下降趨勢;兩組用藥組小鼠血清中IFN-γ、IL-10含量與模型組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；3.Q-PCR結(jié)果顯示造模后,小鼠皮膚組織的i110 mRNA、ifnγ mRNA、i14 mRNA表達量均上升。給予PTQX顆粒后,不同劑量用藥組ifnγ mRNA、il4 mRNA表達量均減少,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而小鼠皮膚組織i110mRNA表達量在PTQX顆粒干預(yù)后明顯升高,與模型組比較差異明顯(P0.05)。4.造模后,小鼠脾臟內(nèi)CD5+B淋巴細胞整體數(shù)量所占淋巴細胞的比率明顯下降(P0.01),給予PTQX顆粒后,PTQX高劑量組和PTQX低劑量組CD5+B淋巴細胞較模型組明顯升高(P0.05),趨向于正常。而造模后小鼠脾臟內(nèi)CD4+T淋巴細胞、CD4+IL-4+T淋巴細胞、CD4+IFN-γ+T淋巴細胞、CD4+IL-17+T淋巴細胞、CD5+CD19+淋巴細胞、CD5+CDld+B淋巴細胞、Breg細胞陽性表達率均未見明顯改變,給予PTQX顆粒后,PTQX高劑量組CD5+CD1d+B淋巴細胞陽性表達率明顯增多(P0.05),而低劑量組呈增多趨勢(P0.05)；PTQX高劑量組Breg細胞陽性表達率明顯升高,與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而低劑量組呈增多趨勢(P0.05),其余淋巴細胞陽性表達率與與模型組比較,差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.PTQX顆�？捎行Ц纳艫D樣小鼠模型皮損情況,減輕瘙癢,減少皮膚炎性細胞浸潤；2.IgE、IFN-γ、IL-4、IL-10是培土清心顆粒干預(yù)AD的重要靶點,PTQX顆粒治療AD可能與下調(diào)血清IgE、IL-4含量和皮膚中ifnγ mRNA、il4mRNA含量,上調(diào)i110mRNA含量有關(guān),通過糾正上述細胞因子紊亂、恢復(fù)體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮治療作用；3.PTQX顆�？赡芡ㄟ^刺激CD5‘B淋巴細胞、CD5+CDld+B淋巴細胞、Breg細胞增殖,調(diào)節(jié)特應(yīng)性皮炎患者免疫失衡狀態(tài)。
[Abstract]:This study is a part of the research on the special Chinese medicine dominant disease breakthrough project (Guangdong Finance Association [2015]19), the clinical and basic research of atopic dermatitis (Yuecai [2011]572) in Guangdong province. Our research group developed particles with Spleen Qi, heart Peitu anti-inflammatory antipruritic (PTQX particles), the initial establishment of a mouse model with obvious lesions, and validated in atopic dermatitis (AD) clinical curative effect in. The aim of this study is to construct AD - like mouse model and related evaluation index on the basis of previous studies, and to observe the effect of PTQX particles on the immune network system of AD like mice. The research is divided into 2 parts. The first part is the establishment of animal models and the establishment of evaluation system: Objective: to establish the atopic dermatitis related animal models and related evaluation system based on the modeling methods of atopic dermatitis related animal models at home and abroad. Methods: 1. "atopic dermatitis", "AD", "animal model" as the key words, find relevant literature database, data extraction and analysis according to the quality evaluation of literature, reference to domestic and foreign atopic dermatitis animal model in animal species, sex selection and specific model construction method, suitable for screening the experimental animal species, sex and modeling methods; 2. after the establishment of the model, comprehensive delayed hypersensitivity and chronic eczema evaluation index, the lesion score and behavior observation score, scratching number, ear thickness, skin pathology, serum and index evaluation models of disease characteristics. Results: 1. of the domestic and foreign research on atopic dermatitis like animal model, the research object to establish AD like animal model should be selected female C57BL/6 or BALB/c mice by semi antigen stimulation induced model induced by 2,4-, drug 4-dinitrofluorobenzene (DNFB; 2.) compared with the normal control group, model group mice back pathological lesions obvious hyperkeratosis, parakeratosis, acanthosis, epidermis, dermis showed obvious inflammatory cell infiltration; serum IgE, IL-4 levels were significantly increased (P0.01), and IFN- gamma showed no significant change (P0.05). 3. after modeling, there were significant differences in skin lesions score, behavioral observation score, scratch times and ear thickness between model group and normal group (P0.05). Among them, behavior observation score increased first and then decreased. Compared with the normal group at the same time, the difference was statistically significant (P0.05). The number of scratch times in the model group increased significantly, and the score of skin lesions and the thickness of the auricle increased significantly (P0.01). Conclusion: 1. induced by DNFB method can successfully establish AD mouse model, AD model of skin tissue established a typical chronic inflammation of the skin changes, serological manifestations suggestive in type Th2 cells; 2. model group mice showed chronic inflammatory skin damage, obviously accompanied by itching, and human AD is very similar, the lesion score, pruritus degree, ear thickness, histological and serological changes can be used as an important basis for judging the success of the model. Study on the immune regulation mechanism to the second part of PTQX particles on AD like mice by PTQX Granule on AD like mouse model, from the model, effects of change, blood and skin cell factor number of spleen Breg cells change and to explore the possible mechanism of immune regulation of AD. Methods: 1.. The female C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups, namely, normal group, model group, PTQX high dose group (2 times clinical dose, PTQX granule 1.56g/kg d), PTQX low dose group (clinical equivalent dose, PTQX granule 0.78g/kg. D). Mice were administered orally, medication group hilling and clearing away heart fire with water solution of different concentration by gavage, the normal group and model group were given equal volume of distilled water, the first day of modeling medication administered continuously for 14 days; the first day, seventh day and fourteenth day were observed behavior observation score, scratching number and lesion score, ear thickness and other indicators; 2. by repeated DNFB stimulation induced modeling method, before modeling skin (about the size of 2.5cm * 1.5cm). Modeling the first day back with 0.5%DNFB solution 25 l sensitization, 20 l induced dermatitis DNFB solution within the next fifth days, eighth days, eleventh days, fourteenth days in the mouse ear back, back with 0.2% of the left ear with the matrix solution 20 l for the control group given within 48 hours of the end of the experiment; the method of enucleation were taken back full-thickness skin lesions do change skin routine pathology and mast cell count (toluidine blue staining); 3. by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the content of serum IgE content, serum IFN-, IL-4, IL-10 y Liquichip; RNA 4. from the back skin of mice, and identify its concentration and purity, using quantitative real-time polymerase chain reaction (Q-PCR), IL-4, IL-10 level IFN- gamma mRNA expression in the skin tissue was examined; 5. mice spleen, isolated and cultured spleen cells, after treatment The number and changes of regulatory B cells (Breg) in spleen cells were detected by flow cytometry. Results: 1. weeks after the modeling, model group mice scratching frequency, lesion score and auricle thickness increased significantly compared with normal group (P0.01), PTQX particles, mouse scratching number, lesion score and auricle thickness were significantly decreased (P0.01); behavior observation score tends to Yu Zheng Chang, no statistical significance compared with the normal the difference (P0.05); skin tissue pathological acanthosis alleviated as compared with model group, reduce skin infiltration of inflammatory cells and mast cell count decreased significantly (P0.01; 2.) compared with the normal control group, model group, serum IgE, IL-4 content increased (P0.01), serum IFN- gamma, IL-10 did not change significantly (P0.05), PTQX particles, PTQX high dose group and low dose group of PTQX mice serum IgE levels were significantly decreased (P0.05) compared with the model group, the content of IL-4 in serum of mice PTQX low dose group, the difference was statistically significant (P0.05, PTQX)
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5;R-332

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本文編號：1344842