發(fā)布時(shí)間：2017-12-28 06:01

  本文關(guān)鍵詞：衣原體噬菌體PhiCPG1衣殼蛋白Vp1對(duì)沙眼衣原體作用機(jī)制研究　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 沙眼衣原體 Vp1蛋白 阿奇霉素 MEK/ERK信號(hào)通路 三型分泌系統(tǒng) 作用機(jī)制

【摘要】：研究目的探究Vp1蛋白作用于沙眼衣原體并抑制其生長(zhǎng)的機(jī)制。研究?jī)?nèi)容研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原體后的光鏡下及免疫熒光鏡下的變化;研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原體后不同時(shí)間點(diǎn)MEK/ERK通路p-ERK1/2蛋白的改變,ERK1和ERK2基因的改變,IL-1和IL-8炎性因子的改變;研究Vp1蛋白與阿奇霉素作用于沙眼衣原體后的區(qū)別與聯(lián)系;研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原體后三型分泌系統(tǒng)的改變;研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原體后對(duì)其生長(zhǎng)周期的影響。研究方法對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒菌Vp1-Pet30a(+)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)出的Vp1蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定并純化,純化后的Vp1蛋白透析復(fù)性后進(jìn)行蛋白定量、濾過除菌后使用。將處理后的Vp1和阿奇霉素與沙眼衣原體在Mc Coy細(xì)胞中作用,在光鏡下及免疫熒光鏡下觀察兩者對(duì)沙眼衣原體的抑制作用;提取各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的總蛋白,采用Western Blot方法檢測(cè)各組之間ERK信號(hào)通路p-ERK1/2及總ERK1/2的變化情況;提取各組細(xì)胞的總RNA,采用Realtime-PCR方法檢測(cè)各組之間ERK1及ERK2基因的變化情況;提取各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液上清,用ELISA方法檢測(cè)各組IL-1及IL-8的表達(dá)水平。應(yīng)用純化無菌的Vp1在Mc Coy細(xì)胞中作用于沙眼衣原體,同時(shí)設(shè)置未干預(yù)組和空白作為對(duì)照。培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后,分別提取各組細(xì)胞的總RNA,應(yīng)用Realtime-PCR方法檢測(cè)沙眼衣原體內(nèi)Tarp(CT456)、CT694、Inc A(CT119)、Tep P(CT875)、CT621、Cdsf(CT666)、Hct A(CT743)、Hct B(CT046)、Omc A(CT444)、Omc B(CT443)基因在不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)前后表達(dá)的不同。研究結(jié)果1、重組表達(dá)的Vp1及阿奇霉素對(duì)Mc Coy細(xì)胞內(nèi)正常生長(zhǎng)的沙眼衣原體均有抑制作用,光鏡下及熒光顯微鏡下觀察到包涵體減少,并且其減少的程度與Vp1的及阿奇霉素的濃度呈正相關(guān)。Vp1作用于沙眼衣原體后可與其結(jié)合并跟隨其進(jìn)行復(fù)制。2、Vp1及阿奇霉素作用于沙眼衣原體后均可引起Mc Coy細(xì)胞內(nèi)MEK/ERK通路的改變,p-ERK1/2表達(dá)減少,ERK1及ERK2基因表達(dá)降低,尤以ERK1下降為顯著。3、從Vp1與阿奇霉素起作用的時(shí)間來看,Vp1對(duì)沙眼衣原體的抑制作用主要發(fā)生于衣原體生長(zhǎng)周期的后期,而阿奇霉素對(duì)沙眼衣原體的抑制作用主要發(fā)生于衣原體生長(zhǎng)周期的早期。4、Vp1及阿奇霉素作用于沙眼衣原體后,Mc Coy細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子IL-1及IL-8減少,細(xì)胞炎癥減輕。作用后,IL-1在感染后期減少明顯;IL-8在Vp1干預(yù)后早期即有減少,阿奇霉素干預(yù)后感染后期減少明顯。5、Vp1作用于沙眼衣原體后可導(dǎo)致沙眼衣原體內(nèi)三型分泌系統(tǒng)分泌減弱。感染早期(EB侵入宿主細(xì)胞),Cdsf(CT666)表達(dá)下調(diào),使EB對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力下降。感染后期(即RB轉(zhuǎn)為EB時(shí)期),Tarp(CT456)、CT694表達(dá)水平降低,衣原體的侵襲能力下降。Inc A(CT119)表達(dá)水平上升,衣原體同型融合增多,RB不斷融合形成異常增大的網(wǎng)狀體。Cdsf(CT666)、CT621表達(dá)下調(diào),可使RB轉(zhuǎn)化為EB減少。Tep P(CT875)在整個(gè)生長(zhǎng)周期中表達(dá)水平均降低,提示Vp1可能干預(yù)衣原體與宿主細(xì)胞之間的信號(hào)通路傳遞,干擾包涵體形成。其可能還參與免疫相關(guān)基因的調(diào)控,使宿主細(xì)胞對(duì)衣原體的免疫反應(yīng)增強(qiáng),從而達(dá)到抑制衣原體生長(zhǎng)的目的。6、Vp1作用于沙眼衣原體后,可導(dǎo)致沙眼衣原體生長(zhǎng)周期晚期表達(dá)的基因水平下調(diào)。Hct A(CT743)、Hct B(CT046)、Omc A(CT444)、Omc B(CT443)在Vp1作用于沙眼衣原體后的晚期表達(dá)均較為干預(yù)組有所下降,提示Vp1可能通過某種機(jī)制抑制了沙眼衣原體生長(zhǎng)周期晚期表達(dá)的基因,從而影響RB向EB的轉(zhuǎn)化,抑制沙眼衣原體的增殖。結(jié)論Vp1蛋白可能通過干擾沙眼衣原體生長(zhǎng)的后期RB轉(zhuǎn)化為EB過程來抑制其生長(zhǎng)。
[Abstract]:Objective to explore the mechanism of Vp1 protein acting on Chlamydia trachomatis and inhibiting the growth of Chlamydia trachomatis. Study on the effect of the content changes of Vp1 protein in Chlamydia trachomatis after light microscopy and immunofluorescence microscopy; change the role of Vp1 protein in Chlamydia trachomatis at different time points after MEK/ERK pathway of p-ERK1/2 protein, ERK1 and ERK2 genes, IL-1 and IL-8 of inflammatory factors change; differences and relations of Vp1 and protein azithromycin effect on Chlamydia trachomatis; study of Vp1 protein in Chlamydia trachomatis type three secretion system change; effect of Vp1 protein in Chlamydia trachomatis after the growth cycle of the. The recombinant plasmid Vp1-Pet30a (+) was induced to express. The expressed Vp1 protein was identified by SDS-PAGE electrophoresis and Western Blot. After purification, the purified Vp1 protein was regenerated and protein was quantified and filtrate after sterilization. After treatment of Vp1 and azithromycin and Chlamydia trachomatis in Mc Coy cells. The inhibitory effect of both Chlamydia trachomatis by light microscopy and immunofluorescence microscopy; extraction of total protein of cells in each group at different time points, the changes by using Western Blot method to detect the ERK signal pathway between p-ERK1/2 and ERK1/2; extraction of total RNA cells were detected by Realtime-PCR, the changes between the groups of ERK1 and ERK2 gene; extract supernatant of cells in each group at different time points, the expression level of ELISA was detected by IL-1 and IL-8. The purified aseptic Vp1 was used in the Mc Coy cells to act on Chlamydia trachomatis, and the non dry pregroup and the blank were set as the control. 24h, 36h, 12h cells, 48h, total RNA were extracted from the cells of each group, application of Realtime-PCR method in the detection of Chlamydia trachomatis (CT456), Tarp CT694, Inc A (CT119), Tep P (CT875), CT621, Cdsf (CT666), Hct A (CT743), Hct B (CT046), Omc A (CT444), Omc B (CT443) gene at different time points before and after the intervention of different expression. Results 1. Recombinant expression of Vp1 and azithromycin inhibited the growth of Chlamydia trachomatis in Mc Coy cells. The inclusion bodies were reduced under light microscope and fluorescence microscope, and the degree of reduction was positively correlated with the concentration of Vp1 and azithromycin. Vp1 can be combined with Chlamydia trachomatis and can be replicated with it. 2, Vp1 and azithromycin acting on Chlamydia trachomatis can cause changes of MEK/ERK pathway in Mc Coy cells, p-ERK1/2 expression is reduced, ERK1 and ERK2 gene expression decreases, especially ERK1 decreases. 3, from the time of Vp1 and azithromycin, the inhibitory effect of Vp1 on Chlamydia trachomatis mainly occurred at the late stage of Chlamydia growth cycle, while the inhibitory effect of azithromycin on Chlamydia trachomatis mainly occurred in the early stage of Chlamydia growth cycle. 4, Vp1 and azithromycin acted on Chlamydia trachomatis, the inflammation factor IL-1 and IL-8 produced by Mc Coy cells were reduced, and the inflammation of the cells was reduced. After the effect, IL-1 decreased markedly in the late stage of infection, and IL-8 decreased in the early stage of Vp1 after the intervention, and the infection later decreased significantly after the intervention of azithromycin. 5, the effect of Vp1 on Chlamydia trachomatis can lead to the decrease in the secretion of type three secretory system in Chlamydia trachomatis. At the early stage of infection (EB invasion of host cells), the expression of Cdsf (CT666) was downregulated, which reduced the infection ability of EB to the host cells. The expression level of Tarp (CT456) and CT694 decreased and the invasion ability of Chlamydia decreased in the late stage of infection (that is, when RB turned to EB). The expression level of Inc A (CT119) increased, the Homo fusion of Chlamydia increased and the RB fused to form an abnormal enlargement of the reticular body. The downregulation of Cdsf (CT666) and CT621 expression can reduce RB to EB. The expression level of Tep P (CT875) decreased during the whole growth cycle, suggesting that Vp1 may interfere with the signal transduction between Chlamydia and host cells, and interfere with the formation of inclusion bodies. It may also participate in the regulation of immune related genes, which can enhance the immune response of the host cells to Chlamydia, and thus inhibit the growth of Chlamydia. 6, Vp1 effect on Chlamydia trachomatis, can lead to the gene level of late expression of Chlamydia trachomatis. Hct A (CT743), Hct B (CT046), Omc A (CT444), Omc B (CT443) in the effect of Vp1 on the expression of Chlamydia trachomatis in late intervention group are decreased, suggesting that Vp1 may be a mechanism to inhibit the expression of Chlamydia trachomatis growth cycle late gene, thus affecting the conversion of EB to RB inhibition of the proliferation of Chlamydia trachomatis. Conclusion Vp1 protein may inhibit the growth of Chlamydia trachomatis by transforming RB into EB process.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R374.1

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本文編號(hào)：1344835