本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌PPE44蛋白在脅迫應答和病原菌—宿主相互作用中的功能研究

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【摘要】：結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病仍然是威脅人類健康甚至是生命的重要傳染病。全世界約有三分之一的人口被感染,每年有900萬新增病例和150萬死亡病例。結(jié)核分枝桿菌被認為是最成功、分布最廣泛的胞內(nèi)致病菌之一,通過呼吸進行傳播,從而有效的建立肺部感染。盡管預防疫苗以及用于治療結(jié)核病的抗結(jié)核菌藥物不斷出現(xiàn),但是由于耐藥(包括多耐藥、廣泛耐藥甚至完全耐藥)菌株以及與HIV共感染的出現(xiàn),亟待深入探索結(jié)核桿菌的致病性并在此基礎(chǔ)上開發(fā)新的疫苗或新的治療藥物。結(jié)核桿菌由呼吸道進入肺泡后會面臨來自宿主的多種不利環(huán)境。肺泡巨噬細胞被認為是結(jié)核桿菌感染早期階段的主要效應細胞,組成免疫防御的第一道防線。一旦結(jié)核桿菌通過小飛沫進入肺泡,會被肺泡巨噬細胞內(nèi)化進入吞噬體(phagosome),吞噬體先后與晚期內(nèi)吞體(endosome)及溶酶體(lysosome)融合形成吞噬溶酶體。吞噬溶酶體獲得能酸化吞噬室至pH 5的分子標記,水解酶才能發(fā)揮作用。吞噬溶酶體內(nèi)最終形成一個對入侵結(jié)核桿菌的殺菌環(huán)境:酸性條件、活性氧中間體(ROI)、活性氮中間體(RNI)及營養(yǎng)匱乏等,從而限制細菌的生存和增殖。除此之外,結(jié)核桿菌在傳播過程中還會遭受到紫外的照射,失水,以及低溫等多種壓力。結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)形成了許多策略來逃避巨噬細胞的破壞作用,從而在這些不利環(huán)境中生存及與宿主細胞共存并最終導致疾病,同時這也依賴于多種基因的復雜的表達調(diào)控網(wǎng)絡。結(jié)核分枝桿菌PPE家族基因因其在結(jié)核分枝桿菌與宿主間的相互作用中發(fā)揮重要的功能而越來越被重視。該家族基因主要參與結(jié)核分枝桿菌的毒力,作為抗原變異和免疫逃逸機制的來源等發(fā)揮作用。PPE家族的許多基因受到Sigma因子的調(diào)控,而Sigma因子在細菌壓力反應中發(fā)揮了重要的作用。Sigma缺失菌株對sds誘導的表面活性壓力、氧化壓力以及熱休克等均表現(xiàn)得更加敏感。我們推測rv2770c(ppe44)也可能受到sigma因子的調(diào)控,可能也會在應對這些壓力環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。結(jié)核桿菌能分泌毒力蛋白,這些毒力蛋白能為它們爭取更有利的生存環(huán)境。mrna差異顯示(dd)數(shù)據(jù)表明rv2770c(ppe44)極有可能是一個毒力蛋白,其毒性從不同角度得到驗證:(1)在減毒的結(jié)核桿菌h37ra菌株中下調(diào)表達;(2)在臨床菌株中的表達表現(xiàn)出明顯差異,結(jié)核桿菌北京菌株中的表達明顯高于其他非北京菌株,只存在于致病性分枝桿菌中;(3)感染豚鼠90天后其表達顯著上調(diào)。牛分桿桿菌bcg或結(jié)核分枝桿菌感染小鼠后能引起ppe44特異性的體液和細胞免疫應答,最重要的是與bcg(卡介疫苗)相比,結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠用以ppe44為基礎(chǔ)的亞單位疫苗來接種可以獲得保護作用,因此我們推斷ppe44可能在操縱宿主的免疫應答過程中起重要作用。此外,ppe44在壓力條件下上調(diào)表達。盡管現(xiàn)已對部分ppe家族成員進行了深入研究,但家族中大多數(shù)成員的功能未知。為了研究rv2770c是否在宿主-病原菌互作及應對環(huán)境壓力中發(fā)揮作用,我們以結(jié)核分枝桿菌h37rv基因組為模板,對rv2770c(ppe44)基因進行了克隆,并將其與帶有myc標簽的穿梭質(zhì)粒pnit連接,獲得pnit-rv2770c重組質(zhì)粒后電轉(zhuǎn)到生長速度較快且無毒力的恥垢分枝桿菌mc2155菌株中,成功構(gòu)建了表達rv2770c重組蛋白的重組恥垢分枝桿菌。通過亞細胞分級分離實驗,應用westernblotting技術(shù)檢測了目的蛋白在重組恥垢分枝桿菌中的定位。為了研究rv2770c蛋白的過表達是否會對恥垢分枝桿菌的生長產(chǎn)生影響,我們檢測了表達rv2770c的重組菌與只含有pnit的空載對照菌的生長曲線。為了解rv2770c蛋白是否與結(jié)核分枝桿菌在多種環(huán)境壓力下的存活相關(guān),我們檢測了表達rv2770c的重組菌以及空載菌在酸性條件、sds引起的表面活性壓力、h2o2和聯(lián)胺誘導的氧化壓力及酸性nano2等體外環(huán)境壓力下的生長情況,同時檢測了rv2770c過表達菌株在巨噬細胞內(nèi)的存活情況以及對巨噬細胞的影響。通過本研究,我們發(fā)現(xiàn)rv2770c蛋白定位在細胞表面,能改變恥垢分枝桿菌的菌落形態(tài),但對生物膜形成及滑動能力沒有影響。rv2770c過表達增強了恥垢分枝桿菌對酸性ph、表面活性壓力以及氧化壓力等多種環(huán)境壓力的耐受。表達rv2770c蛋白的重組菌在侵染巨噬細胞過程中,促進宿主細胞死亡,有利于自身存活。實時熒光定量rt-pcr結(jié)果顯示,ms_rv2770c刺激巨噬細胞產(chǎn)生促炎性因子il-6和il-12p40的能力明顯高于ms_pnit。通過信號通路抑制劑實驗,我們發(fā)現(xiàn)rv2770c通過nf-κb、erk1/2和p38信號途徑誘導il-6的分泌,但只有nf-κb信號通路是rv2770c誘導il-12p40分泌所必需的,這說明rv2770c刺激兩種細胞因子分泌的信號途徑可能存在差異。這些結(jié)果揭示了rv2770c可能通過干擾宿主的信號通路來操縱宿主的免疫應答。本研究為進一步探索結(jié)核分枝桿菌Rv2770c(PPE44)基因的免疫學功能及免疫逃避機制奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911

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1 周明亮;結(jié)核分枝桿菌PPE44蛋白在脅迫應答和病原菌—宿主相互作用中的功能研究[D];西南大學;2016年

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本文編號：1231820