本文關(guān)鍵詞：電生理研究中小鼠離體脊髓切片方法的改良

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【摘要】：通過膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄有功能的完整脊髓切片的方法已經(jīng)成為一個重要的工具來研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)要比通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法測定運動神經(jīng)元的電活動有明顯的優(yōu)勢。最近科學(xué)家用分子遺傳學(xué)的方法可以鑒定神經(jīng)元的群落,隨后發(fā)現(xiàn)這些群落可以自發(fā)電活動,這對于研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及機制是非常重要的[1]。如果這項技術(shù)可以發(fā)展成熟,這對于生理學(xué)以及解剖學(xué)都會帶來巨大的收益。由于該技術(shù)方法難度較大,近年采用脊髓離體膜片鉗技術(shù)的實驗報道并不多。實驗困難主要集中在脊髓片制備過程中,如脊髓為細(xì)長型,解剖時間長,不易固定在切片機上;脊髓神經(jīng)纖維多且排列緊密不易快速平整切斷;脊髓神經(jīng)元(尤其是運動神經(jīng)元)對離體損傷的耐受性差等。因此改良實驗方法,找到一種快速易行且神經(jīng)元存活率高的脊髓片制備技術(shù),是深入研究脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電活動的基礎(chǔ)。目的:由于制備活的脊髓切片所需時間長,脊髓前角運動神經(jīng)元細(xì)胞體積大,切片過程中容易受損,對環(huán)境改變的耐受力差,細(xì)胞的的存活率低,為了在活的離體脊髓切片上研究運動神經(jīng)元的電生理以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),本研究通過改良離體活脊髓切片的制備方法,從而減小對脊髓的損傷,縮短脊髓切片的時間,增加脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的存活率。方法:制備離體脊髓切片前首先需制備好人工腦脊液及2%瓊脂塊。將ACSF分成兩份,一份放入于玻璃瓶中然后將玻璃瓶放入冰塊中制備0℃的人工腦脊液,另一份置于燒杯中然后將燒杯放入水浴箱中。通入制備好的95%O_2和5%CO_2混合氣30分鐘,充分飽和。用刀片切下長約1cm寬約0.5cm高約0.7cm瓊脂塊,在長邊正中開垂直半圓形凹槽,用于固定脊髓。傳統(tǒng)制備脊髓切片的方法是取出生8~12天的C57BL/6J近交系小鼠用水合氯醛麻醉后置于冰袋上5min,使小鼠的代謝率下降,更好的保持其細(xì)胞的活力。迅速斷頭,用眼科剪沿脊上正中切口切開皮膚,暴露脊柱。剪斷兩側(cè)肋骨及周圍軟組織,取出整條脊柱迅速置于預(yù)先制備好的冰的人工腦脊液中。在解剖顯微鏡下行椎板切除術(shù),沿背正中線由骶髓向上至胸髓逐個椎骨切開,從切口用顯微鑷仔細(xì)分開椎骨暴露脊髓,之后使用顯微鑷夾住胸髓端,輕輕上提,用顯微剪剪斷脊髓雙側(cè)神經(jīng)根,取出附著有蛛網(wǎng)膜和軟膜的脊髓,在冰ACSF中撕去脊髓表面的蛛網(wǎng)膜和軟膜,并修整為適當(dāng)?shù)拇笮?將制備好的腰髓放在凹槽內(nèi),將瓊脂塊連同脊髓粘貼于切片盒內(nèi)。使用振動切片機沿脊髓水平方向做厚度為450μm切片。將標(biāo)本置于95%O_2和5%CO_2混合氣飽和的ACSF中水浴箱34℃孵育60分鐘備用。本實驗取出生8~12天的C57BL/6近交系小鼠,麻醉后迅速端頭剪斷兩側(cè)肋骨及周圍軟組織,取出整條脊柱迅速置于預(yù)先制備好的冰的ACSF中,去掉頸髓保留至胸段至L5以上組織,盡量修剪干凈椎骨兩旁組織,用帶有200ul塑料吸液頭的的5ml注射器吸入人工腦脊液,從尾側(cè)椎孔內(nèi)向上吹出脊髓,用顯微手術(shù)剪剪下腰髓。將制備好的腰髓放在凹槽內(nèi),將瓊脂塊連同脊髓粘貼于切片盒內(nèi)。使用振動切片機沿脊髓水平切面方向做厚度為450μm切片。將標(biāo)本置于95%O_2和5%CO_2混合氣飽和的ACSF中水浴箱34℃孵育60分鐘備用。用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式,將電壓鉗制在-65~70mv,分別給予0p A、50p A、100p A及150p A階梯狀電流刺激持續(xù)500ms,每個刺激間隔為1s,記錄脊髓前角運動神經(jīng)元的動作電位。結(jié)果:經(jīng)過反復(fù)的實驗我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過1個月左右才能夠熟練掌握椎板切開術(shù)后取出脊髓,制備脊髓切片,而經(jīng)過10天左右時間就可以熟練掌握椎孔內(nèi)注射人工腦脊液法取出脊髓制備脊髓切片。改良的法方可以比采用椎板切開術(shù)取出脊髓的方法更容易掌握,對脊髓的損傷小,取出的脊髓更完整。改良后制備脊髓切片所用的時間比椎板切開術(shù)制備的脊髓切片所用的時間明顯縮短。傳統(tǒng)采用椎板切開的方法制備脊髓切片所用的時間為25.60±2.51分鐘,改良后采用椎孔內(nèi)注射人工腦脊液的方法制備脊髓切片所用的時間為8.60±1.14分鐘,兩種方法制備脊髓切片所用的時間經(jīng)t檢驗比較P0.01,有統(tǒng)計學(xué)意義。改良后制備的脊髓切片中前角運動神經(jīng)元的數(shù)目比椎板切開術(shù)制備的脊髓切片前角運動神經(jīng)元的數(shù)目明顯增多。椎板切開的方法制備脊髓切片中脊髓前角運動神經(jīng)元存活的數(shù)目為3.00±1.58個,采用椎孔內(nèi)注射人工腦脊液的方法制備的脊髓切片中脊髓前角運動神經(jīng)元存活的數(shù)目為8.20±0.84個,兩種方法制備脊髓切片中脊髓前角運動神經(jīng)元存活的數(shù)目經(jīng)t檢驗比較P0.01,有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)測定C57小鼠脊髓運動神經(jīng)元的閾電位平均為-54.2±6.1mv,振幅平均為37.7±8.7mv,單個動作電位時間平均為2±0.3 ms,動作電位上升的速率平均為148.6±4.8mv/ms,動作電位下降的速率平均為-65.6±7.6mv/ms。結(jié)論:采用椎孔注射人工腦脊液的方法制備的脊髓切片手術(shù)時間短,取出的脊髓更完整,細(xì)胞存活的數(shù)目多。改良的方法比椎板切開的方法有明顯的優(yōu)點。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R338

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