本文關(guān)鍵詞：電生理研究中小鼠離體脊髓切片方法的改良

  更多相關(guān)文章： 運動神經(jīng)元 動作電位 離體活脊髓切片 人工腦脊液 膜片鉗全細胞記錄模式

【摘要】：通過膜片鉗全細胞記錄模式記錄有功能的完整脊髓切片的方法已經(jīng)成為一個重要的工具來研究神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)要比通過細胞培養(yǎng)的方法測定運動神經(jīng)元的電活動有明顯的優(yōu)勢。最近科學家用分子遺傳學的方法可以鑒定神經(jīng)元的群落,隨后發(fā)現(xiàn)這些群落可以自發(fā)電活動,這對于研究神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)以及機制是非常重要的[1]。如果這項技術(shù)可以發(fā)展成熟,這對于生理學以及解剖學都會帶來巨大的收益。由于該技術(shù)方法難度較大,近年采用脊髓離體膜片鉗技術(shù)的實驗報道并不多。實驗困難主要集中在脊髓片制備過程中,如脊髓為細長型,解剖時間長,不易固定在切片機上;脊髓神經(jīng)纖維多且排列緊密不易快速平整切斷;脊髓神經(jīng)元(尤其是運動神經(jīng)元)對離體損傷的耐受性差等。因此改良實驗方法,找到一種快速易行且神經(jīng)元存活率高的脊髓片制備技術(shù),是深入研究脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡電活動的基礎。目的:由于制備活的脊髓切片所需時間長,脊髓前角運動神經(jīng)元細胞體積大,切片過程中容易受損,對環(huán)境改變的耐受力差,細胞的的存活率低,為了在活的離體脊髓切片上研究運動神經(jīng)元的電生理以及神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),本研究通過改良離體活脊髓切片的制備方法,從而減小對脊髓的損傷,縮短脊髓切片的時間,增加脊髓神經(jīng)元細胞的存活率。方法:制備離體脊髓切片前首先需制備好人工腦脊液及2%瓊脂塊。將ACSF分成兩份,一份放入于玻璃瓶中然后將玻璃瓶放入冰塊中制備0℃的人工腦脊液,另一份置于燒杯中然后將燒杯放入水浴箱中。通入制備好的95%O_2和5%CO_2混合氣30分鐘,充分飽和。用刀片切下長約1cm寬約0.5cm高約0.7cm瓊脂塊,在長邊正中開垂直半圓形凹槽,用于固定脊髓。傳統(tǒng)制備脊髓切片的方法是取出生8~12天的C57BL/6J近交系小鼠用水合氯醛麻醉后置于冰袋上5min,使小鼠的代謝率下降,更好的保持其細胞的活力。迅速斷頭,用眼科剪沿脊上正中切口切開皮膚,暴露脊柱。剪斷兩側(cè)肋骨及周圍軟組織,取出整條脊柱迅速置于預先制備好的冰的人工腦脊液中。在解剖顯微鏡下行椎板切除術(shù),沿背正中線由骶髓向上至胸髓逐個椎骨切開,從切口用顯微鑷仔細分開椎骨暴露脊髓,之后使用顯微鑷夾住胸髓端,輕輕上提,用顯微剪剪斷脊髓雙側(cè)神經(jīng)根,取出附著有蛛網(wǎng)膜和軟膜的脊髓,在冰ACSF中撕去脊髓表面的蛛網(wǎng)膜和軟膜,并修整為適當?shù)拇笮?將制備好的腰髓放在凹槽內(nèi),將瓊脂塊連同脊髓粘貼于切片盒內(nèi)。使用振動切片機沿脊髓水平方向做厚度為450μm切片。將標本置于95%O_2和5%CO_2混合氣飽和的ACSF中水浴箱34℃孵育60分鐘備用。本實驗取出生8~12天的C57BL/6近交系小鼠,麻醉后迅速端頭剪斷兩側(cè)肋骨及周圍軟組織,取出整條脊柱迅速置于預先制備好的冰的ACSF中,去掉頸髓保留至胸段至L5以上組織,盡量修剪干凈椎骨兩旁組織,用帶有200ul塑料吸液頭的的5ml注射器吸入人工腦脊液,從尾側(cè)椎孔內(nèi)向上吹出脊髓,用顯微手術(shù)剪剪下腰髓。將制備好的腰髓放在凹槽內(nèi),將瓊脂塊連同脊髓粘貼于切片盒內(nèi)。使用振動切片機沿脊髓水平切面方向做厚度為450μm切片。將標本置于95%O_2和5%CO_2混合氣飽和的ACSF中水浴箱34℃孵育60分鐘備用。用膜片鉗全細胞記錄模式,將電壓鉗制在-65~70mv,分別給予0p A、50p A、100p A及150p A階梯狀電流刺激持續(xù)500ms,每個刺激間隔為1s,記錄脊髓前角運動神經(jīng)元的動作電位。結(jié)果:經(jīng)過反復的實驗我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過1個月左右才能夠熟練掌握椎板切開術(shù)后取出脊髓,制備脊髓切片,而經(jīng)過10天左右時間就可以熟練掌握椎孔內(nèi)注射人工腦脊液法取出脊髓制備脊髓切片。改良的法方可以比采用椎板切開術(shù)取出脊髓的方法更容易掌握,對脊髓的損傷小,取出的脊髓更完整。改良后制備脊髓切片所用的時間比椎板切開術(shù)制備的脊髓切片所用的時間明顯縮短。傳統(tǒng)采用椎板切開的方法制備脊髓切片所用的時間為25.60±2.51分鐘,改良后采用椎孔內(nèi)注射人工腦脊液的方法制備脊髓切片所用的時間為8.60±1.14分鐘,兩種方法制備脊髓切片所用的時間經(jīng)t檢驗比較P0.01,有統(tǒng)計學意義。改良后制備的脊髓切片中前角運動神經(jīng)元的數(shù)目比椎板切開術(shù)制備的脊髓切片前角運動神經(jīng)元的數(shù)目明顯增多。椎板切開的方法制備脊髓切片中脊髓前角運動神經(jīng)元存活的數(shù)目為3.00±1.58個,采用椎孔內(nèi)注射人工腦脊液的方法制備的脊髓切片中脊髓前角運動神經(jīng)元存活的數(shù)目為8.20±0.84個,兩種方法制備脊髓切片中脊髓前角運動神經(jīng)元存活的數(shù)目經(jīng)t檢驗比較P0.01,有統(tǒng)計學意義。經(jīng)測定C57小鼠脊髓運動神經(jīng)元的閾電位平均為-54.2±6.1mv,振幅平均為37.7±8.7mv,單個動作電位時間平均為2±0.3 ms,動作電位上升的速率平均為148.6±4.8mv/ms,動作電位下降的速率平均為-65.6±7.6mv/ms。結(jié)論:采用椎孔注射人工腦脊液的方法制備的脊髓切片手術(shù)時間短,取出的脊髓更完整,細胞存活的數(shù)目多。改良的方法比椎板切開的方法有明顯的優(yōu)點。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R338

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 羅君;盧祖能;;肌萎縮側(cè)索硬化癥的研究進展[J];中國康復;2010年06期

2 沈克中;張鏡如;;膈運動神經(jīng)元[J];生理科學進展;1987年02期

3 夏思文;陳世彩;黃益燈;李孟;鄭宏良;;具有濃度梯度的運動神經(jīng)元體外誘向生長模型的建立[J];實用醫(yī)學雜志;2013年23期

4 秦兆冰,董明敏;成纖維細胞生長因子-2對損傷面運動神經(jīng)元代謝的影響[J];解剖學報;2002年06期

5 劉佛林,周麗華,林浩添,吳榮耀,謝環(huán),周靖;神經(jīng)根撕脫后3種鼠類脊髓運動神經(jīng)元的再生反應(英文)[J];中國臨床康復;2004年16期

6 吳偉利;免疫抑制劑治療運動神經(jīng)元綜合征[J];國外醫(yī)學.神經(jīng)病學神經(jīng)外科學分冊;1995年04期

7 姜廣良,顧玉東;胚胎運動神經(jīng)元種植至失神經(jīng)骨骼肌內(nèi)的觀察[J];中華醫(yī)學雜志;1998年06期

8 王菲;王春芳;李鵬飛;蔚洪恩;韓樹峰;李承罡;;免疫磁珠法分離純化胚胎大鼠脊髓源運動神經(jīng)元的方法探討[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2009年04期

9 張文華;吳承遠;李新鋼;徐淑軍;李剛;江玉泉;周茂德;劉猛;;人膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥小鼠模型基因治療中的作用[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2011年11期

10 祝生源;李剛;王存國;張平強;張鈺;薄愛華;王淑強;;供應大白鼠前肢部分肌肉運動神經(jīng)元的脊髓節(jié)段分布和定位[J];張家口醫(yī)學院學報;1989年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李鵬飛;王春芳;;兩種體外培養(yǎng)運動神經(jīng)元方法的比較[A];Proceedings of the 7th Biennial Meeting and the 5th Congress of the Chinese Society for Neuroscience[C];2007年

2 趙文靜;郭瑞臣;Robert G.Berkowitzl;Paul M.Pilowsky;;大鼠喉運動神經(jīng)元接受兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的投射[A];第十三屆中國科協(xié)年會生物醫(yī)藥博士論壇論文集[C];2011年

3 印弘;;肌萎縮性側(cè)索硬化的在體磁共振波譜及擴散張力研究[A];中華醫(yī)學會第十三屆全國放射學大會論文匯編（上冊）[C];2006年

4 鄭梅;樊東升;;NMDA受體不同亞單位分布造成ALS中運動神經(jīng)元選擇性易損[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經(jīng)病學學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

5 程龍珍;汪萌芽;;新生大鼠脊髓切片運動神經(jīng)元的谷氨酸反應及全麻藥的影響[A];2005年中國神經(jīng)心理學學術(shù)會議論文集[C];2005年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 河北醫(yī)科大學附屬以嶺醫(yī)院肌萎縮科 陳金亮;多靶點多途徑培植運動神經(jīng)元[N];健康報;2013年

2 馮衛(wèi)東;美將患者皮膚細胞轉(zhuǎn)變成運動神經(jīng)元[N];科技日報;2008年

3 常麗君;觸覺和運動神經(jīng)元能對視覺信號起反應[N];科技日報;2013年

4 王振嶺　楊叁平 李宗海;中醫(yī)藥聯(lián)合干細胞移植可多靶點多途徑保護培植運動神經(jīng)元[N];健康報;2007年

5 王俊鳴;我學者用人類干細胞分化出運動神經(jīng)元[N];科技日報;2005年

6 陳勇;人類干細胞成功分化出運動神經(jīng)元[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

7 ;兩種天然抗氧化劑對臂叢根性撕脫后脊髓運動神經(jīng)元保護作用的比較[N];中國醫(yī)藥報;2003年

8 劉元江;讓癱瘓小鼠站起來[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 藺輝前;ScAAV9-hIGF1逆軸突靶向運動神經(jīng)元干預ALS小鼠模型作用及機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2016年

2 王莉;缺血再灌注致脊髓神經(jīng)元損傷特點及其致癱機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2016年

3 周暉暉;運動神經(jīng)元間突觸聯(lián)系的形態(tài)學，電生理，以及模型研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2000年

4 趙文靜;大鼠喉運動神經(jīng)元的呼吸功能和非呼吸功能的中樞調(diào)控[D];山東大學;2011年

5 郭艷蘇;免疫介導運動神經(jīng)元損傷模型的建立及其發(fā)病機理[D];河北醫(yī)科大學;2006年

6 李彬;脂多糖對脊髓前角運動神經(jīng)元的損傷作用及機制探討[D];河北醫(yī)科大學;2008年

7 卜暉;活化ARE通路對運動神經(jīng)元保護作用的研究[D];河北醫(yī)科大學;2007年

8 蔚洪恩;神經(jīng)干細胞與運動神經(jīng)元的microRNA和蛋白質(zhì)差異表達及相互作用[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

9 劉曉云;運動神經(jīng)元損傷機制及保護對策研究[D];河北醫(yī)科大學;2007年

10 于繼徐;鐵在谷氨酸興奮性毒性中的重要作用及運動神經(jīng)元保護機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2009年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳永梅;MCM5在后腦面部運動神經(jīng)元發(fā)育中的作用及調(diào)控機制的初步研究[D];成都醫(yī)學院;2016年

2 劉琳琳;成年大鼠脊髓損傷前角運動神經(jīng)元識別的神經(jīng)形態(tài)學研究[D];中山大學;2016年

3 張瑜;Beta-methylamino-alanine(BMAA)導致大鼠運動神經(jīng)元受損的機制及其自噬改變[D];天津醫(yī)科大學;2016年

4 李輝;電生理研究中小鼠離體脊髓切片方法的改良[D];河北醫(yī)科大學;2016年

5 辛銘;Islet1在小鼠脊髓運動神經(jīng)元后期發(fā)育中的作用[D];杭州師范大學;2013年

6 孔衛(wèi)國;誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞向運動神經(jīng)元分化的研究[D];南昌大學;2010年

7 孔祥鏡;脾腎同治法對肌萎縮側(cè)索硬化運動神經(jīng)元保護機制的初步探討[D];廣州中醫(yī)藥大學;2010年

8 張燕紅;睪酮對脊髓腰骶髓前角運動神經(jīng)元的保護作用[D];上海交通大學;2010年

9 任愛兵;免疫介導的運動神經(jīng)元損傷模型中血清和腦脊液氨基酸的測定[D];河北醫(yī)科大學;2006年

10 武士興;大鼠毛囊神經(jīng)嵴干細胞向運動神經(jīng)元的誘導分化[D];第二軍醫(yī)大學;2014年

，

本文編號：1201562