本文關(guān)鍵詞：小鼠CXCR4基因慢病毒載體構(gòu)建與真核表達(dá)

  更多相關(guān)文章： CXC型趨化因子受體 慢病毒載體 基因表達(dá) FT細(xì)胞

【摘要】：本研究旨在克隆小鼠CXC型趨化因子受體4(CXCR4)基因,構(gòu)建攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的CXCR4重組慢病毒載體并在真核細(xì)胞中表達(dá)。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞為模板克隆全長型CXCR4基因,連接至克隆載體pCR-Blunt,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后亞克隆至慢病毒轉(zhuǎn)移載體,構(gòu)建攜帶EGFP及CXCR4雙順反子結(jié)構(gòu)的自身失活型重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒;同時(shí)構(gòu)建LV-IRES-EGFP作為對照質(zhì)粒;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與包裝質(zhì)粒及包膜蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293FT,超速離心濃縮病毒顆粒后轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測EGFP的表達(dá),Western blot鑒定CXCR4蛋白表達(dá)。結(jié)果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,構(gòu)建重組慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及對照質(zhì)粒LV-IRES-EGFP,三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后獲得病毒滴度可達(dá)到108TU/ml。以重組慢病毒顆粒感染293FT細(xì)胞后第3天,在熒光顯微鏡下觀察到較強(qiáng)綠色熒光表達(dá),FCM檢測顯示感染效率可達(dá)95%,FCM及Western blot結(jié)果顯示感染后293FT細(xì)胞表達(dá)CXCR4蛋白。結(jié)論:成功構(gòu)建自身失活型慢病毒載體LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)。
【作者單位】： 徐州市兒童醫(yī)院感染科;徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科;
【基金】：徐州市科技創(chuàng)新計(jì)劃(編號XZZD1138)
【分類號】：R363
【正文快照】： CXC型趨化因子受體4(CXC chemokinereceptor 4,CXCR4)是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromalderived factor 1,SDF-1)受體,為含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體,在不同物種間具有高度保守性,人和小鼠的同源性為91%,主要差別為小鼠CXCR4蛋白的N端較人的CXCR4多2個(gè)氨基酸(0516)85583722殘

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