發(fā)布時間：2017-11-03 13:39

  本文關(guān)鍵詞：小鼠CXCR4基因慢病毒載體構(gòu)建與真核表達

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【摘要】：本研究旨在克隆小鼠CXC型趨化因子受體4(CXCR4)基因,構(gòu)建攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的CXCR4重組慢病毒載體并在真核細胞中表達。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓細胞為模板克隆全長型CXCR4基因,連接至克隆載體pCR-Blunt,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后亞克隆至慢病毒轉(zhuǎn)移載體,構(gòu)建攜帶EGFP及CXCR4雙順反子結(jié)構(gòu)的自身失活型重組慢病毒表達質(zhì)粒;同時構(gòu)建LV-IRES-EGFP作為對照質(zhì)粒;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與包裝質(zhì)粒及包膜蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞293FT,超速離心濃縮病毒顆粒后轉(zhuǎn)染293FT細胞,采用熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)(FCM)檢測EGFP的表達,Western blot鑒定CXCR4蛋白表達。結(jié)果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,構(gòu)建重組慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及對照質(zhì)粒LV-IRES-EGFP,三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293FT細胞后獲得病毒滴度可達到108TU/ml。以重組慢病毒顆粒感染293FT細胞后第3天,在熒光顯微鏡下觀察到較強綠色熒光表達,FCM檢測顯示感染效率可達95%,FCM及Western blot結(jié)果顯示感染后293FT細胞表達CXCR4蛋白。結(jié)論:成功構(gòu)建自身失活型慢病毒載體LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核細胞中獲得表達。
【作者單位】： 徐州市兒童醫(yī)院感染科;徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科;
【基金】：徐州市科技創(chuàng)新計劃(編號XZZD1138)
【分類號】：R363
【正文快照】： CXC型趨化因子受體4(CXC chemokinereceptor 4,CXCR4)是基質(zhì)細胞衍生因子(stromalderived factor 1,SDF-1)受體,為含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體,在不同物種間具有高度保守性,人和小鼠的同源性為91%,主要差別為小鼠CXCR4蛋白的N端較人的CXCR4多2個氨基酸(0516)85583722殘

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