本文關(guān)鍵詞：TSG-6對HCMV感染引起的TNF-α和IL-6表達(dá)水平下調(diào)的研究

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【摘要】：目的檢測人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染細(xì)胞后腫瘤壞死因子α刺激基因-6 (tumor necrosis factor a stimulated gene 6,TSG-6)的表達(dá)情況；研究TSG-6對HCMV感染所致炎癥反應(yīng)的作用及其對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB (nuclear factor-kappaB,NF-KB)核定位的改變,為HCMV的免疫逃逸機(jī)制和HCMV所致的炎癥性疾病治療提供新的思路。方法(1)在人胚成纖維細(xì)胞中增殖HCMV并通過PCR, IFA及電鏡觀察對其進(jìn)行鑒定,后通過空斑形成實(shí)驗(yàn)測定病毒滴度。(2)用HCMV(MOI=2)感染人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞(ARPE-19),并設(shè)正常細(xì)胞對照組和滅活病毒感染組。在病毒感染后的第24h、48 h、72h、96h和第120h提取總RNA及蛋白,采用RT-qPCR和Western Blot檢測各組不同時(shí)間點(diǎn)TSG-6 mRNA和蛋白表達(dá)水平,檢測TSG-6是否參與HCMV所致的炎癥反應(yīng)過程。(3)將重組人TSG-6蛋白(recombinant human TSG-6 protein, rhTSG-6) 100 ng/mL作用于HCMV感染的MRC-5細(xì)胞作為rhTSG-6干預(yù)組,設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒對照組。在病毒感染的第24h、48h、72h、96h和第120h收集各組細(xì)胞培養(yǎng)物上清,采用ELISA方法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)物上清中TNF-a和IL-6表達(dá)水平,檢測TSG-6對HCMV誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性因子的抑制作用。(4)與病毒對照相比,在rhTSG-6作用6h后,用IFA檢測NF-κB核定位情況,用Western Blot檢測rhTSG-6作用24h、48h、72h、96h、120h后NF-κB蛋白表達(dá)水平,探討TSG-6對HCMV感染引起的NF-κB核定位改變的影響。結(jié)果(1)病毒感染細(xì)胞后,出現(xiàn)明顯的病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變圓,折光性增強(qiáng)；PCR對HCMV AD169株UL83、UL86兩種基因擴(kuò)增,均出現(xiàn)特異性條帶；IFA檢測HCMVpp65抗原陽性,熒光顯微鏡下出現(xiàn)蘋果綠綠熒光信號(hào)；透射電鏡下觀察到典型的HCMV形態(tài)特征。(2) RT-qPCR結(jié)果顯示,MRC-5細(xì)胞在病毒感染后的第72 h時(shí),TSG-6mRNA表達(dá)明顯升高,約為細(xì)胞對照組的19倍(tD=17.12,P0.01)；第96h達(dá)到高峰,約為細(xì)胞對照的376倍(tD373.15,P0.01)；第120 h時(shí)開始下降,約為細(xì)胞對照組的113倍(tD=111.25,P0.01)。ARPE-19細(xì)胞在病毒感染后第96h開始出現(xiàn)TSG-6mRNA的明顯表達(dá),約為細(xì)胞對照組的15倍(tD14.25,P0.01),感染后第120 h約為細(xì)胞對照組的354倍(tD=352.42,P0.01)細(xì)胞對照組和滅活病毒感染組TSG-6mRNA表達(dá)量極少,且隨著時(shí)間變化不明顯。Western Blot結(jié)果證實(shí),TSG-6蛋白在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)也隨之升高。(3) rhTSG-6作用于HCMV感染的MRC-5細(xì)胞后與病毒對照組相比,細(xì)胞培養(yǎng)物上清中TNF-α、IL-6水平明顯下降(p0.05)。(4)免疫熒光檢測結(jié)果顯示rhTSG-6干預(yù)組NF-κB核移位減弱；Western Blot對rhTSG-6 (100g/mL)干預(yù)組的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),NF-κB p65蛋白表達(dá)與各時(shí)間點(diǎn)病毒對照組的NF-κB p65蛋白表達(dá)相比明顯減弱(P0.01)。結(jié)論(1)TSG-6參與HCMV引起的炎癥反應(yīng)過程,在HCMV感染后期呈現(xiàn)高表達(dá)；(2)TSG-6能下調(diào)HCMV引起的相關(guān)炎性因子的表達(dá)；(3)TSG-6對HCMV引起的NF-κB核移位具有抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：人巨細(xì)胞病毒 腫瘤壞死因子α刺激基因-6 核轉(zhuǎn)錄因子-κB
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-27
• 結(jié)果27-34
• 討論34-38
• 不足之處及下一步計(jì)劃38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 附錄一：個(gè)人簡歷43-44
• 附錄二：致謝44-45
• 附錄三：綜述45-55
• 參考文獻(xiàn)52-55

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