本文關(guān)鍵詞：人凝血因子Ⅶ基因在CHO-K1細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)與鑒定

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【摘要】：目的在CHO-K1細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)所克隆的人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的cDNA序列并表達(dá)其產(chǎn)物。方法首先從HepG2細(xì)胞中克隆人FⅦcDNA序列,將克隆得到的序列連接到pMD18-T載體上經(jīng)測序驗(yàn)證后,將其與pcDNA3.1載體連接,構(gòu)建得到重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FⅦ。將構(gòu)建得到的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,72 h取樣,采用ELISA、Western blotting等方法對細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解物作鑒定。結(jié)果克隆得到的序列經(jīng)NCBI比對后為FⅦ轉(zhuǎn)錄突變體Ⅱ基因序列,克隆得到的基因未見氨基酸突變,重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FⅦ經(jīng)PCR、雙酶切、測序驗(yàn)證正確。ELISA法未在上清中檢測到目的蛋白,而在細(xì)胞裂解液中檢測到了目的蛋白;Western blotting檢測到表達(dá)產(chǎn)物有與FⅦ標(biāo)準(zhǔn)品類似的分子量為50 kD左右的特異性條帶。結(jié)論在轉(zhuǎn)染后的CHO-K1細(xì)胞裂解液上清中成功表達(dá)了hFⅦ蛋白。
【作者單位】： 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院輸血研究所;
【關(guān)鍵詞】： 人凝血因子Ⅶ CHO-K細(xì)胞 克隆 基因表達(dá)
【分類號(hào)】：R329
【正文快照】： 人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ,hFⅦ)是1種維生素K依賴性單鏈糖蛋白,在參與凝血過程中會(huì)導(dǎo)致纖原的產(chǎn)生[1,2],在血液凝固過程中發(fā)揮極其重要的作用,是凝血塊形成起始的關(guān)鍵分子之一[3,4]。FⅦ可分泌到外周血中,主要以凝血酶原的形式存在[5~7],其可以通過活化因子Ⅹ

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