本文關(guān)鍵詞：登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復(fù)序列具有干擾病毒復(fù)制的作用

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【摘要】：目的構(gòu)建含有登革Ⅱ型病毒(DENV-2)前膜蛋白(prM)基因反向重復(fù)序列(irRNA)的重組質(zhì)粒,評(píng)價(jià)其抑制病毒復(fù)制的效果。方法 DENV-2接種乳鼠,提取總RNA,在正義和反義引物兩端分別加上XhoⅠ和EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn),將經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增的prM全長(zhǎng)基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重組質(zhì)粒pcDNA-asprM;于另一對(duì)正義和反義引物兩端引入酶切位點(diǎn)NheⅠ和BglⅡ,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增prM全長(zhǎng)基因片段插入pMD18-T-vector中,形成含有正向序列的重組質(zhì)粒pMD18-T-prM。限制性內(nèi)切酶NheⅠ和KpnⅠ分別酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-prM和重組質(zhì)粒pcDNA-asprM,得到片段prM和線性化載體pcDNA-asprM,連接構(gòu)建成含有prM反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA。篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中,半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析評(píng)估該質(zhì)粒抑制登革病毒復(fù)制的效果。結(jié)果成功構(gòu)建具有prM反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA。經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-irRNA的實(shí)驗(yàn)組與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照組相比,半定量PCR結(jié)果顯示DENV-2攻擊96 h后NS3的mRNA表達(dá)水平下降28%;實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示,DENV-2攻擊72 h后實(shí)驗(yàn)組病毒拷貝數(shù)比陽(yáng)性對(duì)照組少1.44倍,攻擊96 h后實(shí)驗(yàn)組的NS1表達(dá)量明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論 DENV-2 prM反向重復(fù)序列具有干擾病毒復(fù)制的效果,為登革病毒基因疫苗的研究提供理論依據(jù)。
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系;
【關(guān)鍵詞】： 登革Ⅱ型病毒 前膜蛋白 反向重復(fù)序列 RNA干擾 BHK-細(xì)胞
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(30972566,81271880)~~
【分類號(hào)】：R373
【正文快照】： 登革熱是一種由蚊媒傳播登革熱病毒(DENV)引起的蚊媒傳染病，，病死率較高，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)”一2!。DENV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約1 1 kb，含單一的開放閱讀框，依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋自(C、prM和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋自(NSI、NSZA、NSZB、NS3、NS4A、NS4

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